Tri cellulaire activé par magnétisme : une méthode pour isoler les cellules positives au c-kit

- c-Kit, ou CD117, est un récepteur transmembranaire de la tyrosine kinase exprimé par les cellules souches hématopoïétiques ou progénitrices présentes dans la moelle osseuse et le sang. C’est aussi un marqueur pour la détection de la leucémie myéloïde aiguë.

Pour isoler les cellules positives au c-Kit, prélevez des os de jambe murins et écrasez-les pour libérer la moelle de l’intérieur. Filtrez la suspension de moelle osseuse pour éliminer les fragments d’os. Superposer le filtrat contenant les cellules de la moelle osseuse sur un milieu à gradient de densité et centrifuger pour séparer les cellules mononucléées des autres fractions.

Collectez la couche trouble de cellules mononucléées dans un tube contenant des microbilles conjuguées à des anticorps de souris anti-CD117. Incuber pour que les complexes anticorps-billes se lient aux récepteurs CD117 sur les cellules c-Kit positives. Faites passer la suspension incubée à travers une colonne magnétique placée dans un champ magnétique. Toutes les cellules positives du c-Kit marquées avec les microbilles magnétiques restent dans la colonne, tandis que les cellules non marquées passent à travers.

Retirez la colonne du champ magnétique et rincez le contenu à l’aide d’un tampon approprié pour éluer les cellules positives c-Kit. Dans le protocole suivant, nous montrerons l'isolement de cellules c-Kit positives à partir de la moelle osseuse d'une souris transgénique.

- Pour commencer, récoltez les os de la patte d’une souris euthanasiée. Nettoyez les tissus des os avec un scalpel. Ensuite, placez les os dans du PBS froid sur de la glace et écrasez les os avec un pilon. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube à bouchon à vis de 50 millilitres avec une pipette de 10 millilitres. Lavez le mortier et le pilon plusieurs fois avec du PBS froid et ajoutez la suspension cellulaire dans le tube de 50 millilitres.

Ensuite, centrifugez la moelle osseuse et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette à vide et en verre. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de PBS. À l’aide d’une pipette, ajoutez lentement la moelle osseuse suspendue dans le haut du polysaccharose à température ambiante.

Après cela, faites tourner le polysaccharose à 400 G pendant 20 minutes avec le frein éteint. Après la cétrifugation, prélever l’interface trouble de la cellule mononucléée totale à l’aide d’une pipette et la transférer dans un nouveau tube de 15 millilitres. Portez le volume à 10 millilitres avec du PBS et retirez 20 microlitres pour compter.

Après la cétrifugation, jetez le surnageant et placez la pastille sur de la glace. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans du PBS avec de l’EDTA et du BSA. Ajouter des microbilles CD117 à la suspension cellulaire et vortex pour mélanger. Après cela, incubez la suspension pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, portez le volume à 10 millilitres avec plus de PBS avec EDTA et BSA et centrifugez à 1 200 G à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Utilisez le vide pour éliminer le surnageant et suspendre la pastille cellulaire dans du PBS avec de l’EDTA et du BSA. Ensuite, ajoutez trois millilitres de PBS avec EDTA et BSA dans un support magnétique avec une colonne magnétique et laissez-le s’écouler dans un tube de collecte. Une fois que le tampon a fini de circuler dans la colonne, ajoutez la suspension de cellule et laissez-la s’écouler à travers la colonne dans le tube de collecte.

Ensuite, ajoutez 5 millilitres supplémentaires de PBS avec EDTA et BSA dans la colonne et rincez-la immédiatement avec le piston. Retirez le piston et répétez le rinçage avant de compter les cellules. Après avoir centrifugé les cellules, retirez le surnageant et suspendez la pastille cellulaire dans de l’IMDM complet pour la culture. Cultivez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.