Transduction à médiation rétrovirale : une méthode pour introduire un gène cible dans des cellules cancéreuses

- Les rétrovirus sont des virus à ARN qui se répliquent en utilisant la transcriptase inverse pour convertir leur génome d’ARN en ADN double brin et s’intégrer de façon permanente dans le génome de l’hôte. Les nouvelles particules virales sortent de la cellule et peuvent infecter d’autres cellules. La thérapie génique anticancéreuse utilise des vecteurs rétroviraux pour introduire des gènes thérapeutiques dans les cellules cibles via une technique appelée transduction pour réguler à la baisse le gène muté ou éliminer les cellules.

Pour obtenir des vecteurs rétroviraux à titre élevé, transfectez les cellules HEK 293 avec un mélange de transfection contenant le plasmide rétroviral souhaité, le plasmide d’emballage et un agent de transfection approprié. Incuber les cellules. L’agent transfecteur facilite l’administration des deux plasmides dans les cellules.

Le plasmide rétroviral code le génome viral avec le gène cible, tandis que le plasmide d’emballage code pour les protéines de l’enveloppe virale. La machinerie cellulaire des cellules d'emballage forme des particules rétrovirales et les libère dans le milieu. Prélever le surnageant viral et centrifuger pour prélever les cellules.

Transférez la concentration souhaitée de particules virales et de cellules cancéreuses dans une plaque de culture recouverte de fibronectine pour faciliter la liaison des protéines de l’enveloppe virale aux cellules. Incuber les cellules. Collectez les cellules et effectuez une cytométrie en flux pour analyser l’efficacité de la transduction. Ce protocole effectuera une transduction rétrovirale de cellules de moelle osseuse de souris c-Kit-positives.

- Tout d’abord, combinez l’ADN plasmidique rétroviral avec le plasmide d’emballage, le chlorure de calcium et l’eau dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 500 microlitres de HBS dans un autre tube de 1,5 millilitre. Ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte dans le tube contenant HBS tout en mélangeant simultanément avec le vortex réglé sur le réglage le plus bas.

Incuber le mélange de transfection à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Pendant la période d’incubation, ajoutez de la chloroquine aux cellules HEK et conservez-les dans l’incubateur. Après avoir ajouté le mélange de transfection, incubez les cellules pendant 8 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2, en changeant le milieu cellulaire en ajoutant très lentement 14 millilitres de milieu DMEM 10 frais. Le pipetage lent contre la paroi de la boîte permet d’éviter tout décapage des cellules HEK.

Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2. Utilisez une seringue de 10 millilitres pour recueillir le surnageant viral. Fixez ensuite un filtre à seringue de 0,45 micromètre à la seringue. Plongez le surnageant viral dans un nouveau tube de prélèvement. Prélever le surnageant viral environ 16 heures plus tard.

Après cela, ajoutez 2 millilitres de fragment de fibronectine humaine recombinante dans du PBS dans des plaques de culture à 6 puits non traitées. Le lendemain, à l’aide d’une pipette, retirez la fibronectine des plaques. Bloquez les plaques avec 2 % de BSA dans du PBS et incubez les plaques à température ambiante pendant 30 minutes.

Utilisez un aspirateur pour retirer le BSA et lavez les plaques avec du PBS avant de les retirer avec l’aspirateur. Après cela, ajoutez immédiatement le surnageant viral filtré et centrifugez la plaque pendant deux heures. Utilisez un aspirateur pour retirer le surnageant et faites tourner à nouveau la plaque.

Ensuite, retirez le surnageant avec un aspirateur et lavez les puits recouverts de virus avec du PBS. Retirez le PBS avec l’aspirateur. Ajoutez les cellules de souris c-Kit+ précédemment cultivées dans les puits recouverts de virus. Après la centrifugation, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. 48 heures après la transduction, granulez les cellules par centrifugation et mettez-les en suspension dans le tampon FACS numéro 1.