Sélection immunomagnétique négative : une méthode pour purifier les lymphocytes B des cellules mononucléées du sang périphérique

0 vues3:06 min • April 30th, 2023

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Les cellules mononucléées du sang périphérique ou PBMC comprennent les cellules B, les cellules T, les cellules tueuses naturelles ou NK et les monocytes. Les lymphocytes B produisent des molécules d’immunoglobuline pour combattre l’infection. Dans la leucémie, ces cellules se multiplient et métastasent dans différents organes.

Pour isoler les lymphocytes B, commencez par une suspension de PBMC isolés. Ajoutez un mélange d’anticorps primaires dirigé contre des molécules spécifiques de surface cellulaire appelé cluster de différenciation ou CD. Des anticorps spécifiques se lient à la molécule CD-3 sur les lymphocytes T, à la molécule CD-14 sur les monocytes et à la molécule CD-16 sur les cellules NK, laissant les lymphocytes B non marqués.

Ensuite, lavez l’échantillon pour éliminer les anticorps non liés. Ajoutez des microbilles magnétiques conjuguées à des anticorps secondaires à l’échantillon. Les anticorps secondaires se lient à la région FC des anticorps primaires attachés à des cellules spécifiques. Placez le tube contenant la suspension cellulaire marquée sous l’influence d’un champ magnétique. Sur le terrain, les cellules marquées magnétiquement migrent et se lient à la paroi du tube, ce qui entraîne une sélection négative des cellules indésirables. Prélever le surnageant contenant des lymphocytes B enrichis dans un tube de collecte frais.

Dans ce protocole, nous effectuerons une sélection immunomagnétique négative des lymphocytes B leucémiques des PBMC de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique.

Jetez le surnageant et mettez à nouveau en suspension 10 millions de PBMC dans un millilitre de tampon d’isolement, qui est du PBS avec 0,1 % de BSA et 2 millimolaires d’EDTA, avec un pH ajusté à 7,4. Les lymphocytes de la LLC doivent maintenant être purifiés à partir des préparations PBMC. Ensuite, ajoutez 10 microgrammes d’anticorps primaires monoclonaux anti-CD-3, CD-14 et CD-16 de souris, et incubez pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius.

Après avoir lavé les cellules avec le tampon d’isolement et les avoir centrifugées à 500 fois g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius, remettre en suspension les 10 millions de PBMC dans 1 millilitre de tampon d’isolement. Incuber les cellules remises en suspension avec 100 microlitres de billes magnétiques lavées pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius avec remise en suspension douce. Ensuite, placez le tube dans le support d’aimant pendant deux minutes et transférez le surnageant avec les cellules non liées dans un tube frais avec une pipette de 5 millilitres. Après cette étape, les lymphocytes purifiés de la LLC sont prêts à être utilisés.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026