Détection des ROS avec coloration DCFH-DA : mesure des ROS totaux dans les lignées cellulaires du cancer colorectal
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Recherche sur le cancer
0 vues • 3:50 min • April 30th, 2023
- Les espèces réactives de l’oxygène sont produites principalement à partir des mitochondries lorsque des électrons s’échappent de la chaîne de transport d’électrons. Ces électrons se combinent avec l’oxygène moléculaire, donnant naissance à diverses espèces réactives de l’oxygène, ou ROS. Dans les cellules cancéreuses, il y a surproduction d’espèces réactives de l’oxygène. Ces molécules ROS hautement réactives peuvent endommager par oxydation les membranes, les protéines et l’ADN à l’intérieur de la cellule.
L’augmentation des niveaux de ROS endommage l’ADN, entraînant l’activation d’une voie de signalisation oncogénique provoquant la progression du cancer. Par conséquent, il est essentiel de détecter les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène produites par les cellules cancéreuses.
Commencez par prélever des cellules cancéreuses du cancer colorectal humain dans un milieu de culture approprié. Ensuite, ensemencez ces cellules dans une plaque multipuits et ajoutez une solution DCFH-DA. Incuber la plaque pendant la durée souhaitée. DCFH-DA traverse la membrane cellulaire. Une fois à l’intérieur de la cellule, DCFH-DA se transforme en DCFH en présence d’une enzyme estérase cellulaire. De plus, l’oxydation du DCFH par les espèces réactives de l’oxygène produit des molécules fluorescentes vertes.
Observez les cellules au microscope fluorescent. L’intensité de la fluorescence verte indique le niveau d’espèces réactives de l’oxygène dans la cellule. Dans le protocole suivant, nous utilisons le colorant DCFH-DA pour colorer les espèces réactives de l’oxygène dans les cellules cancéreuses colorectales.
- Pour colorer les cellules, retirez le milieu contenant le médicament et lavez-les une fois avec du DMEM. Ajoutez 500 microlitres de solution de travail DCFH-DA dans chaque puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez le DCFH-DA des puits et lavez-les deux fois avec du DMEM et une fois avec du PBS.
Ensuite, ajoutez 500 microlitres de PBS dans chaque puits. Utilisez le canal protéique fluorescent vert sur le microscope à fluorescence pour prendre des images représentatives des cellules. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 200 microlitres de tampon de dosage de radio-immunoprécipitation dans chaque puits.
Incuber la plaque sur de la glace pendant cinq minutes et recueillir les lysats cellulaires dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes à 21 130 x g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, transférez 100 microlitres de surnageant dans une plaque noire à 96 puits. Utilisez un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 485 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 530 nanomètres pour mesurer la fluorescence dans chaque puits.
Ensuite, mesurez la concentration en protéines avec le test Bradford en transférant 1 microlitre de surnageant dans une plaque transparente de 96 puits avec 100 microlitres de solution de dosage de protéines. Utilisez les concentrations de protéines pour normaliser les intensités de fluorescence.
Aperçu
Cette étude examine la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules cancéreuses colorectales et leur rôle dans la progression du cancer. La méthodologie consiste à colorer les cellules cancéreuses avec du DCFH-DA afin de mesurer les niveaux de ROS par microscopie de fluorescence.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Recherche sur le cancer
- Stress oxydatif
Contexte
- Les espèces réactives de l'oxygène sont principalement produites par les mitochondries.
- La surproduction d'ERS est associée aux lésions de l'ADN et à la progression du cancer.
- La détection des niveaux d'ERS est essentielle pour comprendre le comportement des cellules cancéreuses.
- Le DCFH-DA est une sonde fluorescente utilisée pour mesurer les ERS dans les cellules.
Objectif de l'étude
- Quantifier les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules humaines de cancer colorectal.
- Comprendre les implications des espèces réactives de l'oxygène dans la progression du cancer.
- Mettre en place une méthode fiable de détection des espèces réactives de l'oxygène par microscopie de fluorescence.
Méthodes utilisées
- Cultiver des cellules humaines de cancer colorectal dans un milieu approprié.
- Colorer les cellules avec du DCFH-DA et incuber.
- Laver les cellules et les observer au microscope à fluorescence.
- Mesurer l'intensité de fluorescence pour quantifier les niveaux de ROS.
Résultats principaux
- Une fluorescence verte accrue indique des niveaux plus élevés d'espèces réactives de l'oxygène (ROS).
- Les mesures de fluorescence sont corrélées à la concentration en protéines.
- La méthode détecte efficacement les espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules cancéreuses.
Conclusions
- Les niveaux de ROS sont significativement élevés dans les cellules cancéreuses colorectales.
- La coloration par DCFH-DA est une méthode valide pour évaluer le stress oxydatif.
- Comprendre la dynamique des ROS peut orienter les stratégies de traitement du cancer.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La détection quantitative des espèces réactives de l'oxygène (ROS) totales dans des lignées cellulaires de cancer colorectal permet une réduction des risques mécanistiques et une validation des cibles en découverte en oncologie. Le protocole de marquage par DCFH-DA offre une mesure normalisée et reproductible des ROS, renforçant la fiabilité prédictive des programmes de biologie du cancer en phase précoce. Cette capacité éclaire le tri et la priorisation des portefeuilles en associant le stress oxydatif aux voies de signalisation oncogéniques et à la progression de la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier le stress oxydatif comme facteur mécaniste dans les modèles cellulaires de cancer.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles modulant la production ou la réponse aux espèces réactives de l'oxygène (ROS).
- Offre des mesures quantitatives pour l'analyse des voies guidée par des hypothèses.
- Facilite la détection biologique des risques en reliant les niveaux de ROS à la signalisation oncogénique.
Élaboration de tests et criblage
- Établit un dosage quantitatif validé pour la détection des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les lignées cellulaires adhérentes.
- Fournit des résultats fluorescents reproductibles, adaptés au criblage de composés.
- Permet la standardisation et la normalisation du dosage à l’aide de contrôles de concentration en protéines.
- Permet une évaluation fiable de candidats modulateurs du stress oxydatif.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la quantification des ERO avec des modèles pertinents de cancer colorectal.
- Appuie les stratégies translationnelles de biomarqueurs en associant les ERO aux phénotypes cellulaires.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique des voies de stress oxydatif.
- Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque pour les thérapeutiques ciblant les voies redox.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test de détection des ERO par DCFH-DA s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, permettant des tests d'hypothèses solides et une analyse quantitative des voies dans les modèles de cellules cancéreuses.
- Biologie de la découverte : Soutient le test de l'hypothèse nulle concernant l'implication des ERO dans la signalisation oncogénique.
- Écrantage : Fournit des résultats fluorescents quantitatifs normalisés pour évaluer la prêts-à-l'emploi des tests.
- Analytique : Permet la normalisation des mesures des ERO par rapport à la teneur en protéines afin de comparer différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la quantification des ERO à des phénotypes cellulaires pertinents pour la maladie dans le cancer colorectal.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable et évolutible pour la mesure du stress oxydatif dans divers programmes d'oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et les études mécanistiques.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles standardisés, reproductibles et évolutifs de quantification des ERO.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » et réduit les risques biologiques en phase avancée dans les portefeuilles en oncologie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques modulant le statut redox.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence et en analyses par lecteur de plaques.
- Requiert un accès à des cultures cellulaires validées, à des réactifs de coloration et à des dosages de quantification des protéines.
- Exige une standardisation interéquipes des conditions de dosage et des protocoles de normalisation.
- Adaptable à divers modèles de cellules adhérentes moyennant une optimisation appropriée.
- Dépend d'une normalisation précise par rapport à la teneur en protéines pour la comparaison quantitative.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026