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- Les microARN ou miARN sont de petits ARN non codants qui régulent l’expression des gènes en dégradant l’ARNm ou en bloquant sa traduction en protéines fonctionnelles. Les miARN circulants sont des biomarqueurs potentiels du cancer et sont extractibles des fluides corporels comme le plasma. Pour commencer, mélangez le plasma avec une solution dénaturante qui homogénéise simultanément l’échantillon et inhibe les ribonucléases dégradant l’ARN.
Traiter avec du phénol-chloroforme acide et centrifuger pour séparer l’échantillon en deux phases, une phase organique inférieure contenant de l’ADN et des protéines, et une phase aqueuse supérieure contenant de l’ARN. Récupérer la phase aqueuse. Ajoutez de l’éthanol absolu pour précipiter l’ARN de la solution.
Amener la concentration d’éthanol de l’échantillon à 25 % pour créer une première condition propice à une grande séparation de l’ARN. Transférez le mélange dans une cartouche filtrante pré-assemblée et centrifugez. Les gros ARN s’immobilisent sélectivement sur le filtre, tandis que les plus petits miARN s’accumulent dans le filtrat.
Par la suite, augmentez la concentration d’éthanol à 55 % pour favoriser l’isolement des miARN. Transférez le filtrat dans une nouvelle cartouche filtrante et centrifugez-la pour piéger les miARN. Placez la cartouche sur un tube collecteur et ajoutez un tampon d’élution approprié. Centrifugeuse pour éluer les miARN dans le tube. Dans le protocole suivant, nous montrerons l’isolement des miARN circulants à partir du plasma de patients atteints de cancer colorectal.
Pour commencer, transférez 400 microlitres de l’échantillon de plasma dans un tube de 2 millilitres sans RNase. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de solution dénaturante dans le tube. Ajouter 4 microlitres de 1 nanomolaire spike-in.
Après avoir mélangé la solution, ajoutez 800 microlitres de phénol-chloroforme acide. Vortex la solution pendant 60 secondes et centrifuger à vitesse maximale pendant 15 minutes. Ensuite, transférez le lysat contenu dans la phase aqueuse supérieure dans un tube propre, en prenant soin de ne pas perturber l’interphase.
Mesurer le volume de la phase aqueuse récupérée et ajouter 1/3 de volume d’éthanol au lysat. Ensuite, placez une cartouche filtrante dans un tube de collecte frais. Transférez jusqu’à 700 microlitres du mélange de lysat d’éthanol dans la cartouche filtrante. Centrifugez la cartouche filtrante pendant 30 secondes à 10 000 x g.
Ensuite, mesurez le volume total de l’écoulement continu. Ensuite, ajoutez les 2/3 du volume d’éthanol au filtrat et mélangez bien. Placez une deuxième cartouche filtrante dans un tube de collecte frais. Ensuite, transférez jusqu’à 700 microlitres de l’échantillon dans la cartouche et centrifugez à 10 000 x g pendant 30 secondes avant de jeter le flux.
Ajoutez 700 microlitres de solution de lavage de microARN dans la cartouche filtrante et centrifugez-la avec un tube de collecte à 10 000 x g pendant 15 secondes. Jetez le flux continu et remettez la cartouche filtrante dans le même tube.
Après cela, déplacez la cartouche filtrante dans un nouveau tube de collecte. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution d’élution préchauffée dans la cartouche. Centrifugez la cartouche filtrante à 10 000 x g pendant 30 secondes pour récupérer les microARN.