Isolement de l’ADN microbien dans les selles : étude de l’effet de l’enrichissement de l’environnement sur la diversité du microbiome dans un modèle de tumeur murine

0 views • 3:46 min • April 30th, 2023

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- L’enrichissement de l’environnement, ou EE, fait référence aux modifications des paramètres du logement pour obtenir des effets bénéfiques sur diverses maladies telles que le cancer. Chez une souris porteuse d’une tumeur, l’EE active le système immunitaire et réduit l’inflammation, ce qui améliore finalement le microbiote intestinal et améliore le taux de survie. Pour étudier les changements dans le microbiote intestinal, ajoutez la quantité souhaitée de tampon de lyse des selles dans un tube contenant les selles de souris.

Centrifugez l’échantillon et transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ajouter un tampon de lyse au chlorure de guanidinium qui dénature la DNase et la RNase. Ensuite, ajoutez de l’éthanol et transférez l’échantillon dans une colonne de spin de silice.

L’éthanol aide l’ADN à se lier à la silice. Centrifugez l’échantillon. Maintenant, transférez la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajoutez un tampon d’élution à la colonne pour éluer l’ADN.

Centrifugez l’échantillon et jetez la colonne. Transférez l’échantillon dans un tube PCR et exécutez une PCR pour amplifier l’ADN. Chargez l’ADN sur du gel d’agarose et effectuez une électrophorèse pour quantifier la taille de l’ADN microbien. Dans le protocole suivant, nous isolerons l’ADN des selles pour analyser l’effet EE sur le microbiote du côlon chez la souris tumorigène.

- Utiliser une trousse commerciale pour isoler l’ADN microbien des selles en suivant un protocole de détection des agents pathogènes dans les selles. Ce faisant, transférez les échantillons du congélateur à moins 80 degrés Celsius sur de la glace sèche et pesez-les. Ensuite, mettez en place une PCR qui amplifie l’ADN microbien comme décrit dans le protocole texte. Ensuite, nettoyez les produits de réaction à l’aide de billes magnétiques.

Pour le nettoyage, centrifugez d’abord brièvement la plaque PCR de l’amplicon pour extraire les produits de réaction. Ensuite, faites vortex les billes magnétiques pour les disperser uniformément et transférez bien 20 microlitres d’aliquotes à chaque réaction. Mélangez soigneusement les billes avec la solution en pipetant lentement 10 fois sur tout le volume. Ensuite, laissez les perles reposer pendant 5 minutes.

Ensuite, placez la plaque PCR sur un support magnétique et attendez 2 minutes que les surnageants disparaissent après la collecte magnétique des billes. Ensuite, retirez et jetez les surnageants. Ensuite, avec la plaque toujours sur l’aimant, remplissez chaque puits de perles avec 200 microlitres d’éthanol frais à 80 % et attendez 30 secondes. Ensuite, retirez soigneusement le surnageant.

Répétez cette étape de lavage une fois et laissez les perles sécher à l’air libre pendant 10 minutes. Maintenant, éluez les produits de réaction des billes en retirant la plaque du support magnétique et en ajoutant 52,5 microlitres de Tris dans chaque puits. Mélangez complètement les billes dans la solution en pipetant lentement tout le volume 10 fois. Ensuite, collectez les billes sur le support magnétique comme précédemment et transférez 50 microlitres de surnageants sur une plaque PCR propre. Couvrez la plaque d’un adhésif transparent et conservez-la à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine maximum.

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Last updated: 25 July 2026