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Recherche sur le cancer
0 vues • 4:55 min • April 30th, 2023
- Les organoïdes sont des constructions cellulaires in vitro tridimensionnelles qui s’auto-organisent pour imiter les principales caractéristiques tissulaires de leur organe d’origine. Pour commencer le marquage, traitez les organoïdes récoltés avec un cocktail d’enzymes protéolytiques et collagénolytiques pour dissocier les cellules en suspension. Centrifugeuse pour séparer les cellules du surnageant contenant des enzymes. Jetez le surnageant. Dissoudre la pastille cellulaire à l’aide d’un milieu contenant des vecteurs lentiviraux. Ces virus recombinants portent la séquence codante d’une protéine fluorescente verte ou GFP.
Les virus fusionnent avec les cellules et libèrent leur matériel génétique et certaines enzymes virales dans le cytoplasme. La transcriptase inverse virale synthétise l'ADN viral complémentaire qui se déplace dans le noyau de l'hôte. L’intégrase virale aide à incorporer l’ADN viral contenant la séquence GFP dans le génome de l’hôte. Cultivez ces cellules transduites dans une matrice extracellulaire ou une plaque de culture recouverte d’ECM. Aspirez le fluide et centrifugez-le pour recueillir toutes les cellules non attachées. Remettez les cellules en suspension dans une ECM supplémentaire.
Superposer la suspension sur la culture adhérente pour favoriser la viabilité cellulaire. Une fois que la matrice se solidifie, ajoutez du milieu de culture et incubez pour faciliter la formation d’organoïdes. Observez la culture au microscope à fluorescence. Les cellules transduites synthétisent des protéines fluorescentes vertes. Les organoïdes formés à partir de ces cellules présentent une positivité à la GFP. Le protocole suivant démontre la transduction lentivirale de la GFP dans les cellules organoïdes du cancer colorectal dérivées de patients.
- Après 7 à 10 jours de culture, détachez mécaniquement les organoïdes à l’aide d’un grattoir à cellules stériles et transférez les organoïdes dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour leur centrifugation. Ensuite, mettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de PBS avec un léger tapotement pour une autre centrifugation. Pour dissocier les organoïdes du cancer colorectal, ajoutez 500 microlitres de solution enzymatique protéolytique et collagénolytique dans les tubes et mélangez en tapotant doucement.
Après 10 minutes à température ambiante, ajoutez 500 microlitres de milieu complété par 1 % de FBS aux cellules, et pipetez très doucement la suspension cellulaire plusieurs fois pour briser les organoïdes.
- Le pipetage en douceur des organoïdes humains du CCR pendant le passage est essentiel pour maintenir une formation de sphéroïdes intacte en culture.
- Centrifugez à nouveau les cellules et remettez les granules en suspension dans 100 microlitres de 5 stock de lentivirus GFP et 400 microlitres de milieu de culture organoïde frais pour le cancer colorectal.
- Il est essentiel d’infecter les organoïdes du CCR humain avec un titre élevé de lentivirus GFP, en particulier pour atteindre une efficacité d’infection de près de 100 %.
- Ajustez le volume dans chaque tube pour obtenir une cellule tumorale dissociée de 5 fois 10 à la cinquième par 500 microlitres de concentration moyenne, et placez 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à 12 puits recouverte d’une matrice extracellulaire artificielle à 12 puits, comme démontré. Après 18 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, transférez les surnageants flottants contenant des cellules dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre pour la centrifugation, suivie d’une remise en suspension des pastilles dans 70 microlitres de matrice extracellulaire artificielle par tube sur de la glace.
Pour améliorer la viabilité des cellules cancéreuses colorectales, superposez la matrice extracellulaire artificielle contenant des cellules tumorales sur les organoïdes tumoraux dans la plaque à 12 puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes. Lorsque l’enrobage artificiel de la matrice extracellulaire s’est solidifié, nourrissez les cultures avec 1 millilitre de milieu de culture organoïde CRC frais complété par 1 % de FCS et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours. Ensuite, observez les cellules infectées par microscopie à fluorescence pour confirmer une positivité GFP de près de 100 % et renvoyez les cellules dans l’incubateur pendant 4 à 6 jours supplémentaires.