JoVE Encyclopedia of Experiments
Recherche sur le cancer
0 vues • 5:19 min • April 30th, 2023
- Commencez par prendre une souris mutante conditionnelle anesthésiée avec un génome modifié portant des séquences spécifiques de reconnaissance de l’enzyme Cre-recombinase appelées inserts LoxP qui flanquent le gène suppresseur de tumeur à muter. Exposer chirurgicalement la cavité abdominale. Localisez le côlon distal et clampez sa partie supérieure. Insérez par voie transanale un tube de qualité médicale et faites-le avancer dans le côlon distal. Rincez le côlon avec une solution saline pour éliminer toute matière fécale. Replacez le tube. Clamp la région inférieure du côlon pour la segmentation. Gonflez le segment à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire adaptée. Cela perfore la barrière muqueuse et augmente l’accessibilité des cellules de la crypte intestinale. Rincez la solution de dissociation.
Ensuite, injectez une suspension adénovirale dans le segment du côlon. Ces vecteurs viraux modifiés codent pour les enzymes Cre-recombinase. Le virus pénètre dans la cellule, libère son ADN dans le noyau et exprime les enzymes. Les protéines reconnaissent les inserts LoxP dans le génome de l’hôte et catalysent la recombinaison spécifique du site, inactivant ainsi le gène suppresseur de tumeur. Cette mutation de perte de fonction favorise la progression du cancer. Suturez l’incision et laissez la souris récupérer. Surveiller pour observer la croissance de tumeurs colorectales isolées. Le protocole suivant montre la génération d’un modèle murin de cancer colorectal par infection adéno-crétique segmentaire.
- Commencez par placer une souris anesthésiée en position couchée et appliquez une pommade sur les yeux de l'animal. Collez la souris dans une position sûre, puis confirmez le niveau de sédation approprié par pincement des orteils. Faites une incision médiane d’environ 15 millimètres dans la peau du bas-ventre. Ensuite, utilisez des pinces pour saisir la musculature de la paroi abdominale et incisez soigneusement le muscle avec des ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale. Après avoir identifié le côlon distal, serrez soigneusement le tissu avec une pince délicate à environ 15 millimètres à proximité de l’anus.
Ensuite, insérez un tube flexible en téflon par voie transanale, en avançant soigneusement le tube jusqu’à ce qu’il atteigne l’occlusion luminale et canulez le tube avec une canule de calibre 30. Connectez une seringue standard de 1 millilitre à la canule et rincez le côlon avec plusieurs millilitres de solution saline normale jusqu’à ce que toutes les matières fécales aient été évacuées. Une fois que le côlon distal est vide, remplacez le tube salin par un nouveau tube en téflon et utilisez une deuxième pince pour occlure le côlon à environ 3 millimètres distal de la première pince.
À l’aide d’une deuxième seringue de 1 millilitre équipée d’une canule de calibre 30, injectez soigneusement 50 à 80 microlitres de trypsine-EDTA à 0,25 % dans le segment du côlon clampé. Le côlon doit gonfler suffisamment pour briser la barrière muqueuse sans perforer le segment de tissu clampé. Après 10 minutes, retirez la pince distale. Ensuite, retirez le tube de trypsine et rincez le côlon distal avec 500 microlitres de solution saline normale.
Après avoir inséré un nouveau tube en téflon, clampez à nouveau le côlon et gonflez le tissu avec 50 à 80 microlitres de solution adénovirale. Après 30 minutes, retirez les pinces et le tube et fermez la paroi abdominale avec des sutures de course 6-0 rapidement résorbables. Fermez la peau à l’aide de pinces chirurgicales et surveillez l’animal sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli.
Pour surveiller la croissance tumorale par coloscopie, placez l’animal porteur d’une tumeur anesthésié en position couchée sur un coussin chauffant et insérez l’endoscope par voie transanale dans le tractus intestinal. Insufflez doucement de l’air sous contrôle visuel pour distendre le côlon. Ensuite, poussez soigneusement l’endoscope vers l’avant jusqu’à ce que la lésion de la muqueuse puisse être identifiée dans le côlon distal, en enregistrant chaque image endoscopique au fur et à mesure qu’elle est acquise pour une évaluation ultérieure. Lorsque toutes les images ont été obtenues, retirez lentement l’endoscope et placez la souris sur un coussin chauffant à 38 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie.