Pourquoi le test d'hypothèse nulle est-il important pour les dosages de la phosphatase de la protéine tau ?

Le test d'hypothèse nulle garantit que les modifications observées de la phosphorylation de la protéine tau après un traitement par phosphatase sont statistiquement significatives, ce qui renforce une validation solide de la cible et réduit les faux positifs en phase précoce de découverte.

Comment l'isolement de la variable indépendante s'intègre-t-il au protocole de phosphorylation de la protéine tau ?

En traitant uniquement l'échantillon test avec une phosphatase alcaline et en conservant un témoin, le dosage isole l'effet de la déphosphorylation, permettant d'attribuer clairement les changements de mobilité sur gel au statut de phosphorylation.

Que permettent les mesures quantitatives des variables dépendantes dans les dosages de la protéine tau ?

La mesure quantitative de la mobilité et de l'intensité de la bande de protéine tau permet aux équipes de comparer les niveaux de phosphorylation entre différentes conditions, fournissant ainsi des informations mécanistiques et appuyant des décisions d'avancement fondées sur les données.

Pourquoi les exigences de réplication sont-elles essentielles pour l'analyse de la phosphorylation de la protéine tau ?

La réplication garantit que les modifications de phosphorylation observées sont reproductibles et fiables, facilitant la collaboration interdisciplinaire et renforçant la confiance dans les résultats de la recherche translationnelle.

Quelles sont les capacités d'analyse statistique nécessaires avant la mise en œuvre du dosage de la protéine tau ?

Les équipes doivent être capables d'effectuer une densitométrie quantitative et des comparaisons statistiques des intensités des bandes afin de valider les résultats des dosages et de soutenir une prise de décision rigoureuse dans le processus de découverte.

Dosage de la phosphatase dans les cellules du CRC : une méthode pour examiner l’état de phosphorylation de la protéine tau dans les cellules cancéreuses colorectales

JoVE Encyclopedia of Experiments

Recherche sur le cancer

0 vues • 4:22 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- La protéine tau se localise en périphérie du nucléole dans les cellules cancéreuses colorectales et aide à maintenir la structure nucléolaire. La plupart du temps, ces cellules expriment la protéine tau hyperphosphorylée, ce qui entraîne une résistance aux médicaments. Ainsi, nous analysons les niveaux de phosphorylation de la protéine tau en effectuant un dosage de la phosphatase.

Commencez par prendre le lysat cellulaire contenant la protéine totale des cellules cancéreuses colorectales humaines dans deux flacons étiquetés comme test et contrôle. Traitez l’échantillon d’essai avec l’enzyme phosphatase alcaline. La phosphatase alcaline élimine les groupes phosphate de tau, tandis que le flacon de contrôle conserve la protéine tau phosphorylée.

Ensuite, analysez l’échantillon et le tau de contrôle sur un gel de polyacrylamide pour séparer les protéines. La protéine tau phosphorylée se déplace plus lentement sur le gel que la protéine tau non phosphorylée. Électrolotter l’échantillon de protéine sur une membrane appropriée et ajouter des anticorps primaires correspondant à la fois à la protéine tau phosphorylée et à la protéine tau normale.

Incuber le tampon pendant la nuit. Traitez le transfert avec un anticorps secondaire conjugué à une enzyme rapporteure qui se lie à la région Fc de l’anticorps primaire. Enfin, développer le transfert à l’aide d’un substrat chimiluminescent pour identifier la protéine tau à partir de l’échantillon total de protéines présent dans le transfert. Dans le protocole suivant, nous ferons la démonstration de l’analyse de la phosphatase pour évaluer l’état global de phosphorylation de tau dans les cellules CRC.

- Après avoir préparé des échantillons contenant 20 microgrammes de protéines totales, ajoutez deux microlitres de tampon de phosphatase alcaline et 10 microlitres de phosphatase alcaline à chacun. Ensuite, ajoutez de l’eau distillée de sorte que le volume final de chaque échantillon soit de 20 microlitres.

Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant l’incubation des échantillons, préparez des échantillons supplémentaires à la même concentration, mais sans phosphatase à des fins de comparaison. Après une heure, arrêtez la réaction en ajoutant soit de l’EDTA à une concentration finale de 50 millimolaires, soit de l’orthovanadate de sodium à une concentration finale de 10 millimolaires.

Ajoutez un tampon de chargement de gel 4X SDS fraîchement préparé contenant 400 millimolaires de DTT. À l’aide d’un bloc chauffant, incubez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vortex les échantillons, puis laissez-les refroidir à température ambiante pendant 10 à 15 minutes.

Ensuite, chargez 13 microlitres d’échantillon par puits ainsi que l’échelle de poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide à 10 %. Connectez le système d’électrophorèse à une source d’alimentation et réglez la tension à 70 volts pendant 20 minutes pour déplacer les échantillons de protéines du gel d’empilement dans le gel de résolution.

Après cela, augmentez à 125 volts et faites fonctionner le gel pendant environ 70 à 120 minutes, jusqu’à ce que les échantillons et l’échelle de protéines atteignent la fin du gel. À l’aide d’un système d’électrobuvardage humide, transférez le gel sur une membrane de fluorure de polyvinylidène à 100 volts pendant environ 100 minutes.

Ensuite, incubez la membrane pour éponger l’albumine sérique bovine à 4 % pendant 90 minutes à température ambiante. Incuber le transfert pendant la nuit dans une solution d’anticorps primaires à 4 degrés Celsius. Le lendemain, lavez la tache trois fois avec PBST, en lavant pendant sept minutes à chaque fois.

Vidéos connexes

0 Vues

Dernière mise à jour : 22 août 2026

Dosage de la phosphatase dans les cellules du CRC : une méthode pour examiner l’état de phosphorylation de la protéine tau dans les cellules cancéreuses colorectales

Aperçu

Composantes clés de l'étude

Domaine scientifique

Contexte

Objectif de l'étude

Méthodes utilisées

Résultats principaux

Conclusions

Questions fréquemment posées

Pertinence sectorielle pour les cadres

Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique

Début de la découverte et validation de la cible

Développement de criblages et de tests

Recherche translationnelle et préclinique

Intégration des pipelines et des flux de travail

Impact opérationnel et organisationnel

Considérations relatives à la mise en œuvre

F.A.Q. sur la bio-pharmacie

In Vitro agrégation essais utilisant la protéine tau hyperphosphorylée

In Vitro Dosage pour l’étude de l’agrégation de la protéine Tau et de dépistage des drogues

Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus

Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

Dosage de la liaison des microtubules dans les cellules CRC : méthode d’examen de la protéine tau de liaison des microtubules dans les cellules cancéreuses colorectales

Dosage par pull-down d’une seule molécule pour l’analyse de la phosphorylation des protéines : une technique à haut débit pour quantifier la phosphorylation des protéines dans le lysat cellulaire

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour identifier les phosphorylations multiples dans les protéines

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l'identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

Dosage pour la Phosphorylation et microtubules liaison avec localisation de la protéine Tau dans les cellules du Cancer Colorectal

Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding