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0 vues • 4:28 min • April 30th, 2023
- Tau est une protéine associée aux microtubules impliquée dans la stabilisation et l’assemblage des microtubules. De nombreuses cellules cancéreuses expriment une protéine tau hyperphosphorylée, qui ne parvient pas à maintenir une liaison bien organisée des microtubules. Pour étudier l’interaction entre la protéine tau et les microtubules, ajoutez du lysat de cellules cancéreuses contenant la protéine tau et une solution de travail pour les microtubules dans un tube à microtubules.
Les protéines tau non phosphorylées présentes dans le lysat cellulaire se lient aux microtubules. Maintenant, ajoutez la quantité souhaitée de tampon PEM dans le tube pour stabiliser l’activité de la tubuline, une protéine qui polymérise en filaments pour former des microtubules. Incuber le mélange pendant la durée souhaitée.
Centrifugez le mélange pour granuler la protéine liée aux microtubules. La protéine non liée reste dans le surnageant. Transférez le surnageant dans un tube frais et remettez la pastille en suspension dans un tampon approprié. Ajoutez un tampon de chargement de gel à la suspension de pastilles remise en suspension et analysez les échantillons sur un gel de polyacrylamide pour séparer les protéines liées aux microtubules et l’électrotransfert sur une membrane appropriée.
Ajouter les anticorps appropriés et développer le transfert à l’aide d’un substrat de chimiluminescence pour identifier les protéines tau liées. Dans le protocole suivant, nous effectuerons le test de liaison des microtubules pour identifier les protéines liées aux microtubules.
- Après avoir préparé des échantillons frais, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ultracentrifuger les échantillons à 100 000 x g et 25 degrés Celsius pendant 60 minutes. Ensuite, transférez 120 microlitres de chaque surnageant contenant du tau non lié dans des tubes propres et étiquetés séparés. Ajoutez 120 microlitres de tampon d’échantillon 5X à la pastille qui contient du tau lié.
Après avoir soigneusement mélangé par vortex et pipetage, transférez le mélange dans des tubes propres et étiquetés. Après avoir préparé des échantillons de concentration protéique équivalente, ajoutez un tampon de chargement de gel 4X SDS frais contenant 400 millimolaires de DTT. Utilisez un bloc de chaleur pour incuber les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Vortex les échantillons, puis laissez-les refroidir à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Chargez 13 microlitres d’échantillon par puits et l’échelle de poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide à 10 %. Connectez les électrodes positive et négative du système d’électrophorèse à une source d’alimentation, puis réglez la tension sur 70 volts pendant 20 minutes.
Après cela, augmentez à 125 volts et faites fonctionner le gel pendant environ 70 à 120 minutes jusqu’à ce que les échantillons et l’échelle de protéines atteignent la fin du gel. Utilisez le système d’électrobuvardage humide pour transférer le gel sur une membrane de fluorure de polyvinylidène à 100 volts pendant environ 100 minutes. Incuber la membrane pour éponger l’albumine sérique bovine à 4 % pendant 90 minutes à température ambiante. Ensuite, incubez toute la nuit dans une solution d’anticorps primaires à 4 degrés Celsius.
Le lendemain, lavez la tache quatre fois avec du PBST, chaque lavage durant sept minutes. Incuber le transfert lavé dans une solution d’anticorps secondaire appropriée pendant 90 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez avec du PBST pendant sept minutes en répétant le lavage quatre fois au total. Développer le tampon à l’aide d’un kit de chimiluminescence. Couvrir d’une pellicule plastique transparente et acquérir des images à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence.