Encyclopédie des expériences JoVE
Recherche sur le cancer
0 vues • 3:50 min • April 30th, 2023
- Les cellules tumorales circulantes, ou CTC, sont les cellules cancéreuses qui proviennent de la tumeur primaire et entrent dans la circulation sanguine. La plupart des CTC peuvent survivre dans la circulation sanguine sans se fixer à la surface ; Par conséquent, nous pouvons les détecter directement à partir du sang de la plupart des patients atteints de cancer.
Les CTC dans le sang peuvent indiquer la propagation de la tumeur à l'intérieur du corps, donc leur identification aide à comprendre la progression du cancer. Commencez par prendre un modèle de souris cancéreuse colorectale anesthésiée et prélevez du sang par ponction cardiaque. Transférez le sang dans un tube conique contenant un milieu à gradient de densité et centrifugez-le pour séparer les composants sanguins.
Jetez la couche supérieure contenant le plasma et collectez la fraction de cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, présente à l’interface dans un tube séparé. Ensuite, ajoutez l’anticorps anti-EpCAM aux cellules PBMC et observez au microscope fluorescent. Les CTC circulantes expriment un marqueur cellulaire connu sous le nom de molécule d’adhésion cellulaire épithéliale ou EpCAM. Par conséquent, les anticorps anti-EpCAM peuvent aider à identifier les CTC positifs à EpCAM.
Collectez les CTC et stockez-les pour une analyse ultérieure en aval. Dans le protocole suivant, nous identifierons les CTC exprimant EpCAM à partir de la fraction cellulaire mononucléée périphérique du sang d’un modèle murin de cancer colorectal.
- Pour isoler les cellules tumorales circulantes au point final expérimental approprié, remplissez des tubes coniques de 15 millilitres avec 5 millilitres de milieu à gradient de densité par tube et transférez soigneusement des échantillons de sang entier prélevés sur des animaux porteurs de tumeurs sur les couches de gradient de densité.
Séparez les cellules par centrifugation et récupérez soigneusement l’interface contenant les cellules mononucléaires. Pipeter les cellules mononucléées dans un nouveau tube de 15 millilitres pour une deuxième centrifugation, suivie de deux lavages en PBS. Après le deuxième lavage, remettre les granulés en suspension dans 200 microlitres de PBS complété par de l’EDTA et ajouter quatre microlitres d’anticorps anti-EpCAM à chaque échantillon pour une incubation de 20 minutes sur de la glace dans l’obscurité.
Ensuite, utilisez un stylo-barrière hydrophobe pour dessiner un cercle d’environ 1 centimètre dans une boîte de Pétri stérile de 6 centimètres par échantillon, et ajoutez 700 microlitres de tampon de prélèvement à chaque cercle, suivis de 50 microlitres de suspension cellulaire. Utilisez un microscope pour vérifier la densité des cellules et laissez les échantillons se déposer pendant environ cinq minutes. Ensuite, examinez la chute de cellules pour vérifier la positivité d’EpCAM et utilisez le micromanipulateur pour transférer les cellules d’intérêt dans 50 microlitres du tampon approprié pour l’analyse ultérieure en aval prévue.