Microdissection laser : une technique pour isoler les cellules envahissantes du cancer colorectal à partir d’un modèle de culture organotypique 3D
JoVE Encyclopedia of Experiments
Recherche sur le cancer
0 vues • 3:53 min • April 30th, 2023
- Les modèles organotypiques 3D du cancer colorectal sont des cultures in vitro conçues pour imiter les microenvironnements tumoraux in vivo. La culture contient souvent des cellules stromales, comme des fibroblastes, co-cultivées avec des cellules épithéliales du cancer colorectal, dans un microenvironnement de matrice extracellulaire approprié.
Dans les cultures établies, les cellules tumorales à potentiel métastatique envahissent la matrice extracellulaire. Pour isoler ces cellules envahissantes, il faut d’abord traiter le modèle organotypique avec du formaldéhyde pour fixer les cellules et la matrice extracellulaire. Incuber avec de l’alcool pour déshydrater l’échantillon.
Ensuite, incorporez-le dans de la cire de paraffine liquide pour générer un bloc tissulaire. À l’aide d’un ultramicrotome, on obtient des tronçons finement tranchés. Montez les sections sur une diapositive en verre appropriée.
Ajouter du xylène pour déparaffiniser les sections. Séquentiellement, incuber les sections à des concentrations décroissantes d’éthanol pour réhydrater les échantillons.
Traiter avec Cresyl Violet pour colorer et différencier les cellules cancéreuses colorectales du microenvironnement. Placez la lame de vitrail face vers le bas sur la platine du microscope. À l’aide d’un logiciel approprié, identifiez les cellules à microdisséquer et délimitez les bords. Tirez le laser pour couper la section en surbrillance et collecter la partie microdisséquée.
Dans le protocole suivant, nous montrerons l’isolement de cellules cancéreuses colorectales à partir d’un modèle de co-culture organotypique 3D par microdissection laser.
- Retirez tout l’organotypique, y compris la feuille de nylon, du puits et placez-le sur du film alimentaire. Coupez en deux la feuille d’organotypique et de nylon à l’aide d’un scalpel jetable propre et fixez les deux moitiés dans du formaldéhyde pendant 24 heures à température ambiante. Remplacez le formaldéhyde par de l’éthanol à 70 % après 24 heures et laissez reposer toute la nuit avant de l’enrober dans la paraffine, de sectionner et de colorer.
Pour effectuer une microdissection laser, sectionnez d’abord l’organotypique à 10 microns d’épaisseur sur des lames montées sur membrane. Après avoir traité les sections comme décrit dans le protocole de texte, préparez-vous à effectuer une microdissection laser à l’aide de la plate-forme choisie.
Placez la lame de verre avec la section colorée à microdisséquer face vers le bas sur la platine du microscope. Montez un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre dans la cassette de collecte et ajoutez 50 microlitres de tampon de lyse cellulaire dans le capuchon dans lequel le tissu microdisséqué s’accumulera. En vision directe, utilisez le joystick pour identifier le tissu d’intérêt, et à l’aide de l’interface logicielle, annotez la section organique colorée, en mettant en évidence les cellules à microdisséquer sur le front d’invasion tumorale.
Demandez au laser de tirer, ce qui devrait à la fois découper la section en surbrillance et propulser le tissu microdisséqué dans le capuchon du tube de la microcentrifugeuse. Procéder au traitement des échantillons par une méthode appropriée pour extraire l’analyte d’intérêt.
Aperçu
Cet article présente un protocole détaillé pour isoler des cellules de cancer colorectal à partir d'un modèle de co-culture organotypique en 3D en utilisant la microdissection laser. La méthode vise à reproduire l'environnement tumoral et à faciliter l'étude du comportement des cellules cancéreuses.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Oncologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les modèles organotypiques 3D imitent les environnements tumoraux in vivo.
- La co-culture avec des cellules stromales augmente la pertinence du modèle.
- La microdissection au laser permet l'isolement précis de cellules spécifiques.
- La compréhension de l'envahissement tumoral est essentielle pour la recherche sur le cancer.
Objectif de l'étude
- Isoler des cellules de cancer colorectal à partir d'un modèle de co-culture complexe.
- Étudier le potentiel métastatique des cellules cancéreuses.
- Fournir une méthode fiable pour l'analyse des microenvironnements tumoraux.
Méthodes utilisées
- Préparation de cultures organotypiques tridimensionnelles comprenant des cellules cancéreuses et stromales.
- Fixation et inclusion des échantillons dans la paraffine.
- Découpe des blocs de tissu en fines tranches pour analyse.
- Utilisation de la microdissection laser pour isoler des cellules spécifiques.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules de cancer colorectal à partir du modèle.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode pour l'étude de l'invasion tumorale.
- Identification des interactions cellulaires clés au sein du microenvironnement.
- Fourniture d'un protocole pouvant être adapté à d'autres types de cancer.
Conclusions
- Le protocole permet une étude détaillée du comportement des cellules cancéreuses dans un contexte pertinent.
- La microdissection au laser est un outil précieux pour la recherche sur le cancer.
- Des études supplémentaires peuvent approfondir ces résultats afin d'explorer des cibles thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La microdissection laser de modèles organotypiques tridimensionnels du cancer colorectal permet l'isolement précis de cellules tumorales invasives au sein d'un microenvironnement physiologiquement pertinent. Cette capacité soutient la détection mécanistique des risques et la validation de cibles au front d'invasion, un point critique pour les portefeuilles en oncologie. Cette approche améliore la confiance prédictive dans le profilage moléculaire en aval et la recherche translationnelle.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier les interactions entre cancer et stroma dans un contexte tridimensionnel proche du physiologique.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles en isolant les cellules présentant des phénotypes invasifs.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en distinguant les populations invasives des non invasives.
- Améliore la fiabilité prédictive pour le classement par ordre de priorité des cibles associées au potentiel métastatique.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des échantillons biologiques validés pour des tests moléculaires et phénotypiques en aval.
- Garantit la reproductibilité et la normalisation en isolant des populations cellulaires définies.
- Permet une analyse quantitative de biomarqueurs liés à l'invasion dans un système contrôlé.
- Facilite une évaluation fiable de composés candidats ciblant les mécanismes d'invasion.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro avec les processus d'envahissement pertinents pour la maladie observés in vivo.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique des cibles d'envahissement.
- Permet des décisions d'avancement ajustées au risque, basées sur le profil moléculaire des cellules invasives.
- Facilite l'identification de biomarqueurs translationnels pour le développement clinique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et la recherche préclinique, assurant ainsi la transition entre la validation de la cible et le développement de biomarqueurs translationnels dans les filières en oncologie.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses sur les mécanismes d'envahissement et les interactions stromales.
- Triage : Fournit des populations cellulaires invasives bien caractérisées et prêtes à être utilisées dans des tests pour des analyses ultérieures.
- Analytique : Fournit des résultats quantitatifs permettant de comparer les phénotypes d'envahissement et les signatures moléculaires.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les données d'envahissement in vitro et les stratégies précliniques et cliniques de biomarqueurs.
- Réutilisation en milieu professionnel : Propose un flux de travail réutilisable pour l'isolement de populations cellulaires définies dans divers modèles de cancer.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique en biologie des invasions.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'isolement des cellules invasives, favorisant la reproductibilité et la reproductibilité à grande échelle.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et améliore l'efficacité du capital en ciblant des invasions validées.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs ciblant la progression métastatique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture 3D, en histologie et en instrumentation de microdissection laser.
- Exige un accès à des plateformes spécialisées d'imagerie et de microdissection.
- Implique une standardisation interéquipes pour la préparation et l'analyse des échantillons.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les types de tumeurs ou les compositions stromales.
- Le débit d'échantillons et la manipulation des tissus doivent être optimisés pour permettre une montée en échelle.
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Dernière mise à jour : 22 août 2026