Essai d’organisation du cytosquelette et de l’adhésion focale : une méthode basée sur l’immunofluorescence pour étudier l’adhésion cellulaire et la propagation sur des substrats

- La morphologie du substrat influence grandement le comportement et les réponses métastatiques des cellules cancéreuses. Un réseau dynamique de cytosquelette d’actine fournit un soutien structurel aux cellules et médie le mouvement cellulaire. De grands complexes protéiques associés à la membrane, appelés adhérences focales, relient le cytosquelette à la matrice extracellulaire, facilitant ainsi la propagation cellulaire.

Pour commencer la coloration, prenez une culture de cellules cancéreuses et traitez-les avec du paraformaldéhyde pour fixer et perméabiliser les cellules. Maintenant, incubez les cellules avec un réactif d’amplification du signal contenant des protéines pour préparer les cellules à réduire la coloration de fond. Ajoutez des anticorps primaires anti-vinculine qui se lient à la vinculine, l’une des protéines du complexe d’adhésion focale.

Ensuite, incubez l’échantillon avec un anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent ciblant l’anticorps primaire. Enfin, traitez les cellules avec des conjugués de phalloïdine marqués fluorescents qui se lient sélectivement aux filaments d’actine du cytosquelette. Observez les cellules à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser pour étudier leurs signaux fluorescents.

Les cellules à la morphologie bien étalée présentent des fibres d’actine définies et présentent des adhérences focales distinctes et allongées contenant de la vinculine. À l’inverse, les cellules mal étalées ne possèdent pas de filaments d’actine définis, mais présentent des adhérences focales ponctuées contenant de la vinculine. Dans le protocole suivant, nous ferons la démonstration d’un test d’immunofluorescence pour étudier le cytosquelette et l’organisation de l’adhésion focale dans les cellules cancéreuses primaires du côlon.

- Amener les substrats à immunocolorer dans le capot laminaire et retirer le milieu de culture. Ensuite, rincez les substrats avec une solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS, et fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez les substrats avec du PBS pendant cinq minutes, soit trois fois au total. Ensuite, incubez les substrats avec 500 microlitres d’amplificateur de signal pendant 30 minutes avant de rincer avec du PBS.

Ensuite, incubez les cellules avec un anticorps monoclonal anti-vinculine à une dilution de 1 à 250 dans du PBS pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les substrats avec du PBS pendant cinq minutes au total, trois fois au total. Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire Alexa Fluor 488 chèvre IgG anti-souris à une dilution de 1 à 200 dans du PBS à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, lavez à nouveau les substrats avec du PBS pendant cinq minutes au total, soit trois fois au total.

Pour visualiser la structure de l’actine F, incubez les cellules avec des conjugués tétraméthylrhodamine-phalloïdine à une concentration de 50 microlitres par millilitre pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez à nouveau les supports comme auparavant. Enfin, procédez à l’imagerie des échantillons à l’aide d’un microscope laser à balayage confocal.

• Focal Adhesion - Protein complex facilitating cell-cytoskeleton and extracellular matrix connection.
• Vinculin - An integral protein within the focal adhesion complex.
• Actin Cytoskeleton - Provides structural support to cells and mediates cellular movement.
• Immunofluorescence - A staining method used to visualize components within a cell.
• Cell Spreading - The process related to cell movement and attachment involving focal adhesions and actin filaments.

• Introduce Focal Adhesion - Protein complex connecting actin cytoskeleton and extracellular matrix (e.g., vinculin).
• Key Concepts - Supporting cell's structural integrity, movement, and interactions (e.g., actin network).
• Underlying Mechanisms - Fundamental processes facilitating cell adhesion, spreading, and movement.
• Connect to Experiment - Using immunofluorescence to visualize actin and vinculin in cancer cells.

• What is focal adhesion and how does it facilitate cellular movement and interaction?
• How does vinculin function within the focal adhesion complex?
• How is immunofluorescence used to study the organization of actin cytoskeleton and focal adhesion?

• Practical Applications – Understanding cellular behavior and responses through immunofluorescence (e.g., cancer research).
• Industry Impact – Enhancing the understanding of cell morphology in biomedical sector (e.g., drug development).
• Societal Importance – Broadening comprehension of diseases trajectory and treatment options (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements - Immunofluorescence marks a significant advancement in cell biology studies.