Préparation de blocs de tissus cutanés congelés : un protocole pour conserver des échantillons de mélanome cutané à partir de la peau dorsale murine

- Les cellules souches des mélanocytes quiescents, en réponse aux rayons UV ou à l’épilation des cheveux, sont activées. Les cellules souches de mélanome activées peuvent entraîner un mélanome cutané, une forme de cancer de la peau. Pour étudier le mélanome, nous préparons des blocs de tissus cutanés congelés pour conserver les structures natives de l’ADN et des protéines pendant la procédure de fixation.

Commencez par placer une souris mélanome euthanasiée sur un lit chirurgical et retirez les poils de la région dorsale de la peau au-dessus de la queue. Excisez la peau et couvrez-la d’un papier filtre. Ensuite, immergez le papier filtre contenant le tissu cutané dans du formol tamponné neutre pendant la durée souhaitée. Le formol pénètre dans le tissu cutané et se lie aux acides aminés, ce qui provoque la réticulation des protéines, conduisant ainsi à la fixation des tissus.

Retirez le tissu cutané du papier et coupez le tissu pour obtenir des morceaux de la taille souhaitée. Maintenant, intégrez les morceaux de tissu verticalement dans un cryomoule rempli de milieu OCT et placez les cryomoules sur de la glace sèche. L’OCT est une matrice d’échantillon qui se solidifie à la congélation et forme une couche gélatineuse autour de l’échantillon de tissu qui le maintient en place. Utilisez les blocs congelés pour d’autres tests histologiques. Dans le protocole suivant, nous préparerons des blocs de tissu cutané congelés de la peau dorsale murine pour étudier le mélanome cutané.

- Pour isoler les échantillons de peau, utilisez une tondeuse électrique pour enlever tous les poils de la zone dorsale de la peau des souris irradiées euthanasiées et brossez légèrement la peau exposée avec un chiffon non pelucheux pour dégager la zone. Faites une petite incision avec des ciseaux pointus juste au-dessus de la base de la queue et insérez de grands ciseaux émoussés dans l’incision pour séparer les tissus conjonctifs sous-cutanés. À l’aide de ciseaux tranchants, coupez soigneusement le long du bord de la région cutanée d’intérêt pour isoler l’échantillon de tissu, et placez le tissu cutané excisé sur une serviette en papier propre.

Ensuite, utilisez une pince émoussée pour étirer la peau afin qu’elle adhère à la serviette et soit tendue. Lorsque tous les échantillons ont été récoltés, placez l’échantillon de peau et le support d’essuie-tout dans un morceau de papier filtre plié immédiatement adjacent au pli, en veillant à ce que l’échantillon soit lisse et non plié ou froissé. Fermez les côtés du papier filtre avec des agrafes et coupez le papier. Ensuite, immergez complètement les échantillons dans du formol tamponné à 10 % pendant 3 à 5 heures à température ambiante avant de laver les mouchoirs avec deux lavages de 5 minutes dans de l’eau déminéralisée.

Après le deuxième lavage, retirez soigneusement toute matière résiduelle des tissus cutanés et coupez les bords de l’échantillon de manière à ce qu’ils ne soient pas déchiquetés. Ensuite, faites trois coupes sagittales dans chaque échantillon de sorte que la largeur des bandes ne dépasse pas 5 millimètres et faites des coupes transversales de sorte que les échantillons ne dépassent pas 20 millimètres de large. Placez un cryomoule contenant la température de coupe optimale ou le milieu OCT en orientation portrait et placez quatre à cinq morceaux de peau sur l’OCT.

Lorsque toutes les pièces sont en place, utilisez deux paires de pinces fines pour amener le bord long de chaque morceau de peau au fond du cryomoule afin que les échantillons soient verticaux à l’intérieur de l’OCT et perpendiculaires à la base du moule. Ensuite, remplissez le moule d’OCT supplémentaire jusqu’à la deuxième lèvre et placez le moule sur une surface plane d’un morceau de glace sèche, à l’aide d’une pince pour ajuster les morceaux de peau qui auraient pu se déplacer pendant le transfert lorsque le bloc commence à geler si nécessaire.