Génération de reconstructions organotypiques de la peau complète : une procédure pour établir un modèle de peau 3D à l’aide d’échantillons de peau humaine

La peau se compose principalement d’une couche supérieure de l’épiderme et d’une couche inférieure du corps dermique. Les cellules épidermiques sont stratifiées en plusieurs couches allant des cellules les moins différenciées présentes à la base aux cellules hautement différenciées à la périphérie. Pour faire pousser un tissu cutané imitant les aspects morphologiques et biochimiques d’une peau normale, nous pouvons établir un modèle de peau organotypique.

Pour commencer, prenez une plaque multi-puits avec un insert membraneux. Ajoutez des fibroblastes dermiques mélangés à du collagène dans l’insert. Incuber pour faciliter la solidification de la matrice de collagène afin d’intégrer les fibroblastes et d’imiter le compartiment dermique de la peau.

Ensuite, ajoutez une suspension de cellules kératinocytaires sur la couche dermique. Incuber la plaque pour permettre aux kératinocytes d’adhérer au compartiment dermique. Compléter la culture avec un milieu d’épidermisation pour initier la prolifération des kératinocytes et la formation d’une couche épidermique.

Enfin, transférez les inserts dans une nouvelle plaque multi-puits. Ajoutez un milieu de stratification tel qu’il ne couvre que la base de la construction, créant ainsi une interface air-liquide. Lors de l’incubation, l’interface air-liquide facilite la différenciation des kératinocytes en un épiderme stratifié multicouche.

Dans le protocole suivant, nous générerons des reconstructions cutanées organotypiques en 3D ayant des homologues dermiques et épidermiques à partir de cellules cutanées humaines isolées.

Pour générer la contrepartie cutanée de la reconstruction cutanée, placez des inserts de membrane de 8 micromètres dans une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Pour chaque insert, remettre en suspension 100 000 fibroblastes dans une solution de neutralisation de gel. Ensuite, mélangez rapidement la suspension de fibroblastes avec du collagène de type 1 dans un rapport de 1:3 dans un volume final de 500 microlitres sans former de bulles.

Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez la suspension à chaque insert. À l’intérieur d’une hotte stérile, placez les inserts à température ambiante sans fluide pendant 30 minutes pour permettre aux gels dermiques de se déposer. Ensuite, couvrez les gels de DMEM et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation d’une nuit, retirez le DMEM des gels dermiques et équilibrez-les avec l’EGM pendant 2 heures à 37 degrés Celsius pour générer la contrepartie épidermique de la peau reconstruite. Ensuite, utilisez une pipette pour retirer l’EGM des gels.

Ensuite, scellez soigneusement 100 000 kératinocytes remis en suspension dans 100 microlitres d’EGM sur chaque gel. Incuber les reconstructions pendant 1,5 heure à 37 degrés Celsius pour permettre aux kératinocytes d’adhérer au gel dermique. À l’aide d’une pointe de pipette, retirez délicatement le gel résiduel de la paroi de l’insert.

Ensuite, couvrez chaque reconstruction avec 800 microlitres d’EGM et cultivez pendant 7 jours à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Retirez délicatement le gel résiduel de la paroi de l’insert à l’aide d’une petite pointe de pipette blanche.

Le jour 8, placez les inserts dans des puits séparés d’une plaque à 6 puits. Ensuite, ajoutez 1,2 à 1,4 millilitres de milieu de mélanome métastatique à chaque puits pour couvrir uniquement la base de la peau reconstruite. Ensuite, incubez pendant 10 à 17 jours à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

• 3D Skin Models - Three-dimensional constructs mimicking natural skin structures
• Human Skin Samples - Biopsy samples of human skin used for scientific study.
• Epidermalization - The process of keratinocyte proliferation and formation of an epidermal layer.
• Organotypic Skin Culture - A method to grow skin tissues that mimic normal skin.
• Reconstructs - 3D skin models created from isolated human skin cells.

• Introduce 3D Skin Models: These are laboratory-grown structures that mimic the natural layers of skin (e.g., human skin samples).
• Key Concepts: They involve processes like epidermalization, that replicate skin cell behaviour (e.g., epidermalization).
• Underlying Mechanisms: The constructs are created by embedding cells in collagen and refining them in different stages.
• Connect to Experiment: The experiment involves creating an organotypic skin culture using a multi-well plate and cell substances.

• What are 3D Skin Models and how are they established (including organotypic skin culture)?
• What does the process of epidermalization entail?
• What are the mechanisms used in creating skin reconstructs?

• Describe Practical Applications: 3D skin models are vital in dermatological research and skincare product testing (e.g., 3D skin models).
• Industry Impact: They greatly influence sectors like healthcare and cosmetology (e.g., human skin samples).
• Societal Importance: Advancements in skin models can benefit personalized medicine and reduce animal testing (e.g., reconstructs).
• Link to Scientific Advancements: They enable understanding of skin diseases and testing of potential treatments.