Génération de reconstructions organotypiques de la peau complète : une procédure pour établir un modèle de peau 3D à l’aide d’échantillons de peau humaine
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0 vues • 4:07 min • April 30th, 2023
La peau se compose principalement d’une couche supérieure de l’épiderme et d’une couche inférieure du corps dermique. Les cellules épidermiques sont stratifiées en plusieurs couches allant des cellules les moins différenciées présentes à la base aux cellules hautement différenciées à la périphérie. Pour faire pousser un tissu cutané imitant les aspects morphologiques et biochimiques d’une peau normale, nous pouvons établir un modèle de peau organotypique.
Pour commencer, prenez une plaque multi-puits avec un insert membraneux. Ajoutez des fibroblastes dermiques mélangés à du collagène dans l’insert. Incuber pour faciliter la solidification de la matrice de collagène afin d’intégrer les fibroblastes et d’imiter le compartiment dermique de la peau.
Ensuite, ajoutez une suspension de cellules kératinocytaires sur la couche dermique. Incuber la plaque pour permettre aux kératinocytes d’adhérer au compartiment dermique. Compléter la culture avec un milieu d’épidermisation pour initier la prolifération des kératinocytes et la formation d’une couche épidermique.
Enfin, transférez les inserts dans une nouvelle plaque multi-puits. Ajoutez un milieu de stratification tel qu’il ne couvre que la base de la construction, créant ainsi une interface air-liquide. Lors de l’incubation, l’interface air-liquide facilite la différenciation des kératinocytes en un épiderme stratifié multicouche.
Dans le protocole suivant, nous générerons des reconstructions cutanées organotypiques en 3D ayant des homologues dermiques et épidermiques à partir de cellules cutanées humaines isolées.
Pour générer la contrepartie cutanée de la reconstruction cutanée, placez des inserts de membrane de 8 micromètres dans une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Pour chaque insert, remettre en suspension 100 000 fibroblastes dans une solution de neutralisation de gel. Ensuite, mélangez rapidement la suspension de fibroblastes avec du collagène de type 1 dans un rapport de 1:3 dans un volume final de 500 microlitres sans former de bulles.
Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez la suspension à chaque insert. À l’intérieur d’une hotte stérile, placez les inserts à température ambiante sans fluide pendant 30 minutes pour permettre aux gels dermiques de se déposer. Ensuite, couvrez les gels de DMEM et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.
Après l’incubation d’une nuit, retirez le DMEM des gels dermiques et équilibrez-les avec l’EGM pendant 2 heures à 37 degrés Celsius pour générer la contrepartie épidermique de la peau reconstruite. Ensuite, utilisez une pipette pour retirer l’EGM des gels.
Ensuite, scellez soigneusement 100 000 kératinocytes remis en suspension dans 100 microlitres d’EGM sur chaque gel. Incuber les reconstructions pendant 1,5 heure à 37 degrés Celsius pour permettre aux kératinocytes d’adhérer au gel dermique. À l’aide d’une pointe de pipette, retirez délicatement le gel résiduel de la paroi de l’insert.
Ensuite, couvrez chaque reconstruction avec 800 microlitres d’EGM et cultivez pendant 7 jours à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.
Retirez délicatement le gel résiduel de la paroi de l’insert à l’aide d’une petite pointe de pipette blanche.
Le jour 8, placez les inserts dans des puits séparés d’une plaque à 6 puits. Ensuite, ajoutez 1,2 à 1,4 millilitres de milieu de mélanome métastatique à chaque puits pour couvrir uniquement la base de la peau reconstruite. Ensuite, incubez pendant 10 à 17 jours à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.
Aperçu
Cet article décrit le processus de création d'un modèle cutané organotypique en 3D qui imite la structure et la fonction de la peau humaine. Le modèle comprend des couches dermique et épidermique, permettant l'étude de la biologie et de la pathologie cutanée.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Ingénierie tissulaire
Contexte
- La peau est composée d'une couche épidermique supérieure et d'une couche dermique inférieure.
- Les cellules épidermiques sont organisées en plusieurs couches présentant des degrés variables de différenciation.
- Les modèles organotypiques sont essentiels pour l'étude de la biologie cutanée.
- La création d'un modèle de peau implique la superposition de fibroblastes dermiques et de kératinocytes.
Objectif de l'étude
- Développer un modèle cutané organotypique fiable.
- Faciliter l'étude des maladies cutanées et de leurs traitements.
- Imiter les propriétés morphologiques et biochimiques de la peau normale.
Méthodes utilisées
- Utilisation de plaques multi-puits avec des inserts membranaires.
- Incorporation de fibroblastes dans une matrice de collagène.
- Ajout de kératinocytes pour former la couche épidermique.
- Utilisation de conditions de culture à l'interface air-liquide.
Résultats principaux
- Génération réussie de constructions cutanées organotypiques tridimensionnelles.
- Mise en place d'un épiderme stratifié multicouche.
- Démonstration de la différenciation des kératinocytes en culture.
- Applications potentielles dans l'étude des maladies cutanées.
Conclusions
- Le modèle cutané organotypique imite efficacement la peau humaine.
- Ce modèle peut être utilisé pour diverses applications de recherche.
- De futures études pourraient explorer des interventions thérapeutiques à l'aide de ce modèle.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mise en place de modèles cutanés tridimensionnels physiologiquement pertinents permet une détection mécanistique des risques dans la validation de cibles en dermatologie et en oncologie, en reconstituant l'architecture cutanée humaine et sa complexité multicellulaire. Cela renforce la fiabilité prédictive de l'évaluation préclinique de candidats thérapeutiques affectant la différenciation épidermique, les interactions dermo-épidermiques ou l'invasion du mélanome. Le modèle fournit un système pertinent pour évaluer l'engagement de la cible et la modulation des voies biologiques dans un contexte humain.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans un système de co-culture stratifié de kératinocytes humains et de fibroblastes dermiques.
- Valeur scientifique : Soutient la validation fonctionnelle des cibles en modélisant la différenciation épidermique et la signalisation dermo-épidermique.
- Valeur scientifique : Facilite la dé-risquisation biologique des cibles impliquées dans l'homéostasie cutanée, la fonction barrière ou la progression du mélanome.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Génère des équivalents cutanés humains standardisés et reproductibles pour l'évaluation quantitative des effets de composés sur la stratification épidermique.
- Valeur opérationnelle : Fournit une plateforme évolutible pour le développement de tests, dotée de compartiments dermiques et épidermiques définis.
- Valeur opérationnelle : Permet des procédés de criblage à débit moyen à l'aide de inserts membranaires en formats multi-puits.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Offre un système pertinent pour l'étude de l'invasion du mélanome et du potentiel métastatique dans un microenvironnement cutané humain reconstruit.
- Valeur scientifique : Permet l'évaluation de biomarqueurs translationnels liés à la différenciation épidermique, à l'invasion ou aux interactions stromales.
- Valeur opérationnelle : Fait le lien entre la découverte et les flux de travail précliniques en fournissant un modèle d'origine humaine pour l'optimisation des candidats et le profilage mécanistique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode de reconstruction organotypique de la peau s'intègre aux flux de travail de biologie fondamentale et de recherche préclinique en fournissant un modèle de peau humaine pour la validation de cibles, le développement de tests et l'étude de l'invasion du mélanome.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant la différenciation épidermique et la communication dermo-épidermique dans un modèle tissulaire humain stratifié.
- Essais de criblage : Assure la préparation des tests grâce à la génération normalisée de couches dermiques et épidermiques, avec des mesures quantitatives de la stratification et de la formation de la barrière.
- Analyse : Facilite l'analyse comparative des effets de composés sur l'épaisseur épidermique, la différenciation des kératinocytes ou la profondeur d'invasion, par des critères histologiques ou d'imagerie.
- Recherche translationnelle : Soutient la continuité préclinique en modélisant l'invasion du mélanome humain dans un microenvironnement cutané reconstruit.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour les programmes de dermatologie et d'oncologie nécessitant des modèles de physiopathologie cutanée humaine.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive en modélisant l'architecture de la peau humaine et sa complexité multicellulaire.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation et la reproductibilité grâce à des rapports définis d'ensemencement cellulaire, à la préparation de la matrice de collagène et à la culture à l'interface air-liquide.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles liées à la peau.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats en fonction de leurs effets sur la différenciation épidermique, l'intégrité dermique ou l'invasion du mélanome.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture primaire de cellules humaines, en préparation de gel de collagène et en techniques de co-culture épithéliale-mésenchymateuse.
- Dépend d'une infrastructure stérile de culture cellulaire, de plaques multi-puits avec inserts perméables et d'un environnement d'incubation contrôlé (37 °C, 5 % CO₂).
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles d'isolement cellulaire, de neutralisation du gel et de renouvellement du milieu pour assurer une cohérence entre laboratoires.
- Implique des adaptations lors de la modélisation de différents phénotypes cutanés ou d'états pathologiques (par exemple, psoriasis, mélanome) en utilisant des sources cellulaires ou des formulations de milieux modifiées.
- Est limité par la variabilité entre donneurs des cellules cutanées humaines primaires, qui peut affecter la cinétique de stratification épidermique et l'activité des fibroblastes dermiques.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026