Culture rapide de mélanocytes et de fibroblastes murins primaires : isolement des mélanocytes et des fibroblastes à partir d’un échantillon de peau murine entière

- La peau est constituée de diverses cellules qui peuplent ses différentes couches. Les mélanocytes, les cellules productrices de mélanine, se localisent à la jonction épidermique-dermique, tandis que les fibroblastes, les cellules génératrices de tissu conjonctif, résident dans le derme.

Pour isoler rapidement les mélanocytes et les fibroblastes, commencez par prélever le tronc d’un bébé souris euthanasié. Coupez la peau ventralement sur toute la longueur du tronc. Retirez la peau contenant la couche épidermique et dermique et coupez le tissu en petits morceaux.

Maintenant, traitez avec un tampon de digestion contenant des enzymes trypsine et collagénase qui dégradent la matrice extracellulaire, libérant les cellules en suspension. Centrifuger pour granuler les cellules et jeter le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un milieu mélanocytaire et transférez la suspension dans une plaque multipuits.

Pendant la culture, la plupart des fibroblastes adhèrent au fond du puits, tandis que les mélanocytes et autres cellules épidermiques restent en suspension. Aspirez les cellules en suspension et ajoutez un milieu spécifique aux fibroblastes à la culture de fibroblastes pour favoriser leur croissance. Transférez la suspension aspirée dans un puits frais enrobé de collagène pour faciliter la formation d’une culture adhérente.

Complétez avec de la génétique, un antibiotique, et ajoutez du milieu de croissance mélanocytaire frais. La génétique élimine sélectivement tous les fibroblastes restants, tandis que le milieu favorise la croissance des mélanocytes par rapport aux autres types de cellules épidermiques. Dans le protocole suivant, nous isolerons les mélanocytes et les fibroblastes de la peau d’un petit murin.

- Dans une armoire à flux laminaire, roulez brièvement le tronc de chaque souris euthanasiée dans une boîte de Pétri stérile contenant 70 % d’éthanol. Retirez la souris de l’éthanol et placez-la dans une boîte de Pétri stérile vide. Ensuite, stérilisez les ciseaux chirurgicaux avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez ces ciseaux pour faire une incision dans la peau sur la face ventrale du tronc, en commençant par le cou et en continuant jusqu’à la queue. À l’aide d’une pince stérile, retirez la peau du tronc de la souris et retirez l’excès de tissu adipeux du côté dermique de la peau.

Placez la peau, côté derme vers le bas, dans une boîte à 6 puits contenant 3 millilitres de 1 solution antibiotique/antimycosique. Incuber à température ambiante pendant 2 à 3 minutes. Ensuite, allumez le hachoir à tissus et ajustez les paramètres à ceux indiqués ici.

- Assurez-vous de faire preuve de prudence lors de l’installation de la lame du hachoir à tissus et lors de l’utilisation de la machine.

- Transférez la peau, côté derme vers le bas, dans une boîte de hachoir à tissus stériles et passez la peau complètement à travers le hachoir à tissus trois fois. Après cela, transférez la peau homogénéisée dans un tube conique stérile de 15 millilitres contenant 3 millilitres de tampon de digestion de la peau.

À l’aide d’une micropipette P1000, mélangez la suspension obtenue en pipetant vigoureusement de haut en bas dix à quinze fois. Fermez le tube conique et incubez l’échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en veillant à retourner le tube toutes les 3 à 5 minutes.

Ensuite, centrifugez le tube dans un rotor à godets oscillant à 750 x g à température ambiante pendant 5 minutes pour granuler les cellules de l’homogénat de la peau. À l’aide d’une micropipette P1000, vous retirez lentement et complètement le tampon de digestion de la peau, en faisant attention de ne pas déranger la pastille.

- Assurez-vous d’aspirer tout le tampon de digestion de la peau. Si vous rencontrez des problèmes, lavez la pastille cellulaire avec 2 à 3 millilitres de milieu mélanocytaire et répétez la centrifugation et retirez l'excès de tampon de digestion de la peau.

- Ensuite, remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire dans 1 millilitre de milieu mélanocytaire en pipetant de haut en bas quinze à vingt fois avec une pipette P1000. Transférez la solution cellulaire résultante goutte à goutte dans un puits non enrobé dans une boîte à 6 puits contenant 1 millilitre de milieu mélanocytaire. Incuber l’homogénat de peau en plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 40 minutes.

Après cela, transférez le surnageant de culture de la boîte non enrobée dans un puits d’une boîte prélavée à 6 puits recouverte de collagène. Ajoutez le G418 au milieu de sorte que la concentration finale soit de 100 nanogrammes par millilitre. Ajoutez 2 millilitres de média de fibroblastes dans un puits de la boîte non enrobée, contenant maintenant des fibroblastes adhérents. Incuber les deux cultures pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après 16 à 24 heures d’incubation, aspirer séparément le milieu et tous les débris de chaque culture. Lavez chaque plat deux fois, en utilisant 1 millilitre de PBS pour chaque lavage. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de milieu de mélanocytes frais à la culture de mélanocytes et ajoutez 2 millilitres de milieu de fibroblastes frais à la culture de fibroblastes.