Préparation du virion du polyomavirus à cellules de Merkel recombinante (MCPyV) : une technique pour produire un virion MCPyV recombinant à titre élevé

- Le polyomavirus à cellules de Merkel, ou MCPyV, est un oncovirus à ADN double brin avec un génome circulaire qui provoque le carcinome à cellules de Merkel, un type de cancer de la peau. Pour préparer les virions MCPyV, il faut d’abord traiter une culture adhérente de cellules d’emballage avec un cocktail contenant un agent de transfection, le génome viral et deux plasmides d’expression codant pour des protéines nécessaires à la promotion de la réplication virale.

Pendant l’incubation, le réactif de transfection forme des lypoplexes avec les plasmides, facilitant leur livraison dans les cellules d’emballage. Une fois à l’intérieur du noyau, la machinerie cellulaire permet l’expression des génomes viral et plasmidique. Les plasmides d’expression codent pour les protéines de l’antigène de la grande tumeur et de l’antigène de la petite tumeur. Ces protéines se déplacent vers le noyau et entraînent la réplication de l’ADN viral. Par la suite, le génome viral code pour des protéines de capside structurelle. Ces protéines se déplacent dans le noyau et aident à l’assemblage des virions recombinants.

Ensuite, récoltez les cellules cultivées. Traitez-les avec une solution contenant du détergent et de la DNase. Le détergent lyse les cellules pour libérer les virus. La DNase dégrade l’ADN plasmidique libre de la suspension. Centrifugeuse pour séparer les débris cellulaires dans la pastille. Chargez le surnageant contenant le virus dans un tube portant un milieu à gradient de densité approprié. Centrifugeuse pour obtenir des fractions concentrées riches en virions dans le milieu à gradient.

Dans le protocole suivant, nous montrerons la préparation de virions MCPyV recombinants à titre élevé à l’aide de cellules 293TT.

- En fin d’après-midi ou en soirée, ensemencez 6 millions de cellules 293TT-28 dans une boîte de 10 centimètres contenant un milieu DMEM supplémenté. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain matin, assurez-vous que les cellules sont confluentes à environ 50 %. Ensuite, transfectez les cellules avec 66 microlitres de réactif de transfection, 12 microgrammes d’ADN R17b de l’isolat MCPyV religé, 8,4 microgrammes de plasmide d’expression ST pMtB et 9,6 microgrammes de plasmide d’expression LT pADL. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain, lorsque les cellules transfectées sont presque confluentes, trypsinisez les cellules et transférez-les dans une boîte de 15 centimètres pour une expansion continue. Lorsque cette parabole devient presque confluente, transférez les cellules dans trois nouvelles paraboles de 15 centimètres. Lorsque ces nouvelles paraboles deviennent presque confluentes, récoltez les cellules comme indiqué dans le protocole de texte. Centrifuger à 180 x g à température ambiante pendant 5 minutes. Ensuite, retirez le surnageant et ajoutez 1 volume cellulaire de DPBS-Mg.

Ajouter 25 micromolaires de sulfate d’ammonium, suivi de 0,5 % de Triton X-100, 0,1 % de benzonase et 0,1 % d’une DNase dépendante de l’ATP. Mélangez bien et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, refroidissez le mélange sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 0,17 volume de chlorure de sodium. Mélanger et incuber sur glace pendant encore 15 minutes. Centrifugeuse à 12000 x g à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Si le surnageant n’est pas clair, retournez doucement le tube et répétez la centrifugation.

Après cela, transférez le surnageant dans un nouveau tube. Remettre la pastille en suspension dans un volume de DBPS complété par 0,8 mole de chlorure de sodium. Centrifugeuse à 12000 x g à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Si le surnageant n’est pas clair, retournez doucement le tube et répétez la centrifugation. Combinez les deux surnageants et centrifugez à nouveau à 12000 x g à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, à l’aide d’une pipette, déposez des gradients d’iodixonal dans des tubes polyallomères de 5 millilitres à paroi mince, comme indiqué dans le protocole de texte. Chargez 3 millilitres de surnageant clarifié contenant un virus sur le gradient iodixonal préparé. Centrifugeuse avec un rotor SW55ti à 234 000 x g et à 16 degrés Celsius pendant 3,5 heures, en veillant à ralentir l’accélération et la décélération. Une fois l’ultracentrifugation terminée, prélever 12 fractions dans des tubes siliconés.