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0 vues • 4:07 min • April 30th, 2023
- Les kératinocytes sont le type de cellule proéminent présent dans l’épiderme ou la couche la plus externe de la peau. Pour modifier génétiquement les kératinocytes, commencez par une culture de cellules phénix d’emballage rétroviral. Par la suite, ajoutez un mélange contenant des vecteurs rétroviraux porteurs du gène d’intérêt et un réactif de transfection. Incuber la plaque pendant la durée souhaitée.
Le réactif de transfection facilite l’administration du matériel génétique viral dans les cellules d’emballage. Ces cellules spécialement conçues codent pour les protéines nécessaires à la production de capside rétrovirale et favorisent l’emballage de l’ARN du vecteur rétroviral porteur du gène d’intérêt. Lors de l’emballage, les virus matures sortent des cellules dans le milieu. Maintenant, transférez le milieu en suspension virale dans une boîte de culture fraîche contenant des kératinocytes primaires. Augmentez la culture avec une solution de polymère cationique souhaitée.
Le polymère cationique neutralise les charges négatives sur les membranes virales et kératinocytaires, augmentant ainsi l’efficacité de la fusion virale avec la surface cellulaire. Lors de la fusion, le virus libère son ARN dans le cytoplasme cellulaire, qui se transcrit inversement en ADN double brin. Cet ADN viral pénètre dans le noyau et s’intègre au génome des kératinocytes, entraînant des altérations génétiques. Dans le protocole suivant, nous montrerons la modification génétique des kératinocytes humains primaires par transfection rétrovirale.
- La veille de la transfection, ensemencez les cellules de phénix dans un milieu complet dans une plaque à 6 puits à une densité de 800 000 cellules par puits. Le jour de la transfection, mélangez 6 microlitres de réactif de transfection avec 100 microlitres de DMEM pour chaque puits à transfecter et incubez à température ambiante pendant 5 minutes. Ajouter le mélange dans un tube contenant 3 microgrammes de vecteur rétroviral pour chaque puits à transfecter et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez tout ce mélange goutte à goutte dans chaque puits des cellules du phénix et incubez les cellules pendant la nuit.
Le lendemain de la transfection, retirez le média des cellules du phénix et ajoutez 2 millilitres de média complet frais. Le même jour, remettre en suspension les kératinocytes humains primaires dans un milieu exempt de sérum de kératinocytes avec des antibiotiques et les semer dans des plaques à 6 puits à une densité de 75 000 cellules par puits.
Le lendemain, récoltez le milieu, qui contient maintenant des particules virales provenant des cellules de phénix transfectées. Passez le média à travers un filtre de 0,45 micron à l’aide d’une seringue pour éliminer toutes les cellules contaminantes. Ajouter 5 microgrammes par millilitre de bromure d’hexadiméthrine au milieu filtré contenant le virus pour aider à médier le processus d’infection.
Ensuite, pipetez 2 millilitres du virus sur les kératinocytes mis la veille. Ensuite, faites tourner les plaques à 6 puits dans une centrifugeuse à 200 x g pendant 1 heure à température ambiante. Après l’essorage, retirez et jetez le support contenant le virus. Lavez les cellules une fois avec 1x PBS, puis ajoutez du KCSFM frais. Le lendemain, infectez le même lot de kératinocytes avec le virus en utilisant la procédure qui vient d’être illustrée.