Essai de formation de colonies de kératinocytes : un essai in vitro pour évaluer la capacité des kératinocytes à se développer en colonies

- L’essai de formation de colonies détermine la capacité des cellules individuelles à proliférer et à former des colonies. Commencer par une excision de la peau dorsale de la souris dans une plaque de culture. Grattez le tissu sous-cutané et la graisse de la face ventrale de la peau. Traitez le tissu avec une solution de digestion. Les enzymes protéolytiques présentes dans la solution dégradent la matrice extracellulaire, induisant la dissociation des cellules épidermiques.

Grattez doucement la couche épidermique pour libérer les cellules et les poils dissociants dans un milieu de récolte. Filtrez la suspension à travers une passoire appropriée pour piéger les poils ou tout débris et obtenez une suspension unicellulaire de cellules épidermiques. Transférez le volume souhaité de cette suspension cellulaire dans une plaque recouverte de collagène contenant une couche adhérente de cellules nourricières arrêtées par la croissance. Complétez avec un milieu adapté qui favorise la survie des kératinocytes.

Pendant la culture, les kératinocytes se fixent à la couche nourricière. De plus, ces cellules nourricières sécrètent des facteurs de croissance et synthétisent des protéines de la matrice extracellulaire qui soutiennent la croissance des kératinocytes. En fonction de la capacité proliférative des kératinocytes individuels, ils commencent à former des colonies. Retirez le support et fixez les colonies. Colorez les cellules avec un colorant approprié pour détecter les colonies pour le comptage. Dans le protocole suivant, nous effectuerons le dosage clonogénique des kératinocytes primaires récoltés sur les souris adultes après un traitement avec des composés d’essai.

- Après avoir prélevé des échantillons de peau dorsale sur des souris adultes euthanasiées, à l’aide d’une pince autoclave et d’un scalpel, placez une peau dorsale à la fois, côté poilu vers le bas, dans une boîte de Pétri mince et grattez le tissu sous-cutané, y compris la graisse de la face ventrale du tissu cutané, jusqu’à ce que le tissu soit semi-translucide.

Placez cette peau grattée dans du PBS jusqu’à ce que toutes les autres peaux restantes soient traitées. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez les échantillons de peau en bandes de 0,5 x 1 à 1,5 centimètre. Placez les bandelettes côté poilu vers le haut dans une boîte de Pétri stérile avant de faire flotter les échantillons côté poilu vers le haut à la surface d’une solution de PBS de 20 millilitres plus 2x Gentamicin complétée par 0,25 % de trypsine dans une boîte de Pétri en plastique de 100 x 20 millimètres pendant 2 heures à 32 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, placez une boîte de Pétri carrée en plastique stérile contenant 15 millilitres de substrat de récolte à une inclinaison de 30 degrés, et utilisez une pince incurvée pour transférer soigneusement une bande de peau flottante dans la boîte. En tenant une nouvelle lame de scalpel à un angle perpendiculaire à la peau et en utilisant une force suffisante mais pas excessive, grattez l’épiderme et les poils de l’échantillon dans le milieu.

Lorsque toutes les bandelettes ont été grattées, décantez soigneusement le surnageant contenant des cellules épidermiques dans un bocal stérile de 60 millilitres contenant une barre d’agitation magnétique de 1,5 pouce, et rincez la boîte de Pétri avec un milieu de récolte supplémentaire pour recueillir les cellules épidermiques restantes.

Portez le volume final dans le bocal à 30 millilitres avec un milieu frais, et remuez la solution de cellules épidermiques à 100 rotations par minute pendant 20 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation d’agitation, dans une enceinte de biosécurité, retirez la barre d’agitation et filtrez la solution cellulaire à travers une passoire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.

À l’aide d’une pince puis d’une pipette, pressez les poils et les matériaux de la couche cornée à travers la crépine pour manipuler le tissu afin de libérer les cellules ciliées piégées, et utilisez 5 millilitres supplémentaires de milieu de récolte pour libérer les cellules ciliées piégées restantes dans le tube.

- Il est essentiel que les cellules de l’épiderme et les cheveux soient manipulés de manière à libérer les cellules des follicules pileux.

- Porter le volume total dans le tube jusqu’à 50 millilitres avec un milieu frais et recueillir le filtrat cellulaire par centrifugation. Remettre la pastille en suspension dans 5 millilitres de milieu de récolte frais et environ 20 triturations avec une pipette de 5 millilitres. Prenez 0,5 millilitre de dilution 1:20 et transférez-le dans un tube de microfuge de 2 millilitres.

Après avoir soigneusement mélangé l’échantillon, prélevez 200 microlitres du tube de microfuge et mélangez doucement avec un volume égal de solution de bleu de trypan à 0,4 %. Mélangez doucement cette solution trois fois et transférez les cellules dans un hémacytomètre pour compter les kératinocytes nucléés.

Marquez toutes les cellules bleu foncé comme cellules non viables et notez les petites cellules rosâtres dorées comme cellules viables. La viabilité moyenne est d’environ 80 % et le rendement final en kératinocytes par souris devrait être d’environ 30 millions de cellules viables. Après le comptage, prélever les cellules avec une autre centrifugation, et pour la culture de masse, remettre en suspension 2 à 4 fois 10 à 10 jusqu’au sixième kératinocytes viables par boîte de Pétri de 35 millimètres dans 2 millilitres de milieu de culture cellulaire.

Pour un test de formation de colonies clonogènes, remettre les cellules en suspension à 1 fois 10 à la troisième kératinocyte par 4 millilitres de milieu E de William modifié avec des suppléments et la concentration sérique par boîte de Pétri de 60 millimètres enrobée de collagène sur des couches nourricières de souris suisses 3T3 irradiées aux rayons X.

Pour la culture de masse, cultivez les cultures à 32 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant la période de culture cellulaire appropriée, en changeant le milieu 24 heures après l’ensemencement initial pour la culture de masse et 3 fois par semaine par la suite.

A la fin de la culture clonale, aspirez le milieu et fixez les colonies dans du formol tamponné à 10 % pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain matin, colorez les colonies avec 0,5 % de Rhodamine B dans de l’eau autoclavée pendant une heure avant de rincer la vaisselle à l’eau froide autoclavée jusqu’à ce que l’eau soit claire. Ensuite, inclinez les plats sur leurs couvercles pour qu’ils sèchent avant de compter les colonies.