Name: Molécules simples à limagerie du transport nucléaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Découvrez la microscopie de molécules uniques pour visualiser le transport nucléaire à travers les complexes du pore nucléaire dans les cellules HeLa. Cette méthode permet d'analyser la dynamique moléculaire avec une résolution nanométrique.

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Ce projet a été soutenu par la recherche de renforcement des capacités de subvention (Bowling Green State University).

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

Des précautions doivent être prises pour assurer une bonne colocalisation des molécules NE et unique au cours de l&#39;expérience. Il est également important de fournir un rapport signal bruit de haute, surtout lorsque le signal est faible en raison de mauvais étiquetage ou de photoblanchiment. Précision de localisation est limitée par le bruit de fond (découlant de sortir du flou de fluorescence, bruit de lecture du CCD, sombre facteurs actuels et d&#39;autres).

molécules simples à l&#39;imagerie du transport nucléaire

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

L&#39;utilité des approches molécule unique microscopie par fluorescence a été prouvée pour être d&#39;un grand résultat dans la compréhension des réactions biologiques au cours de la dernière décennie. L&#39;enquête sur les interactions moléculaires à haute résolution spatiale et temporelle profonde au sein des cellules est resté difficile en raison de la faiblesse inhérente des signaux provenant de molécules individuelles. Des travaux récents par Yang et al. démontré que la microscopie à champ étroit épifluorescence permet la visualisation de transport nucléocytoplasmique au niveau molécule unique. Par l&#39;approche seule molécule, cinétique importante, comme le temps de transport nucléaire et l&#39;efficacité, pour les molécules de fret signal dépendantes et indépendantes ont été obtenues. Ici, nous avons décrit un protocole pour l&#39;approche méthodologique avec une meilleure résolution spatio-temporelle des nm et 12 ms 0.4. L&#39;amélioration de la résolution nous a permis de capture de transitoires de transport actifs et des événements de diffusion passive à travers les complexes des pores nucléaires (NPC) en semi-intactes les cellules. Nous prévoyons que cette méthode soit utilisée dans l&#39;élucidation d&#39;autres événements de liaison et le trafic intérieur des cellules.

Microscopie à molécule unique Approche fourni de nouvelles connaissances sur le transport nucléaire.

Molécules simples à l&#39;imagerie du transport nucléaire

L'utilité des approches de microscopie de fluorescence à molécule unique s'est avérée d'un grand secours pour comprendre les réactions biologiques sur le...

L'enveloppe nucléaire de la cellule contient environ 2000 complexes nucléaires PO qui permettent le transport de molécules hydrosolubles telles que l'ARN, les ribosomes, certaines protéines, les glucides et les molécules de signalisation. En ajoutant des molécules de cargaison marquées à des cellules perméables, il est possible de visualiser par microscopie à fluorescence le déplacement de molécules individuelles à travers le pore nucléaire. Des images en prise de vue instantanée sont nécessaires pour déterminer la localisation ainsi que les caractéristiques spatiotemporelles telles que le temps de transport, l'efficacité d'importation et d'exportation, et la fréquence d'entrée. Bonjour, je suis Alex ov, étudiant en doctorat au laboratoire de microscopie de molécules uniques du Département de biologie de l'Université d'État de Bowling Green.Je suis Asha P Shema, étudiante en master, également du laboratoire de microscopie de molécules uniques. Je suis Juma. Je suis chercheur postdoctoral ici au laboratoire de microscopie de molécules uniques.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'imagerie de molécules uniques permettant d'observer le transport nucléaire à travers les complexes nucléaires de type PO dans les cellules helo. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la translocation de diverses molécules à travers le complexe nucléaire de type PO. Commençons donc.Pour préparer les protéines destinées à l'expérience de transport nucléaire, transformer de façon conventionnelle des JM 1 0 9 E coli exprimant les gènes responsables de la production des protéines cargo nucléaires, les cultiver dans un milieu LB et induire avec du IPTG. Une fois que les cellules sont en phase logarithmique avec une densité optique comprise entre 0,7 et 0,8, centrifuger la culture à 6 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, éliminer le surnageant, peser le culot. Ensuite, resuspendre les cellules dans 10 millilitres de Celtic B par gramme de culot afin d'extraire les protéines adaptées à la purification par affinité et à l'analyse.Ensuite, ajoutez la quantité appropriée de cocktail de protéases dans l'ADN du premier intercalaire et du bêta-mercaptoéthanol. Mélangez le mélange à l'obscurité sur de la glace pendant 30 minutes. Puis centrifugez à 25 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau flacon en vue de la chromatographie. Ajoutez 400 microlitres de nickel NTA et d'acétone dans quatre tubes de microcentrifugeuse. Centrifugez à 16 000 ×g pendant trois minutes.Jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de tampon de lyse et de lavage. Répétez les étapes de lavage précédentes trois fois après le lavage final.Résuspendre le NTA au nickel dans le tampon de lyse et ajouter les quatre tubes dans le flacon contenant le surnageant cellulaire. Agiter lentement le mélange obtenu dans un récipient sombre sur de la glace pendant 60 minutes, pendant que le mélange est en agitation. Préparer une colonne de chromatographie Econo-Pac en l’enveloppant de papier d’aluminium afin d’éviter la photodégradation des protéines fluorescentes.Placer également 12 tubes de collecte dans un support sous la colonne. Une fois le mélange agité pendant 60 minutes, charger 10 millilitres du mélange SNA au nickel NTA et laisser passer complètement. Commencer à collecter les fractions.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de tampon de lavage de lyse. Laissez-le passer complètement. Puis ajoutez 10 millilitres de tampon IZO et laissez-le passer.Continuer à collecter les fractions. Ensuite, faire passer 0,5 millilitre de tampon d'élution et laisser s'écouler en répétant l'application du tampon d'élution jusqu'à ce que les 12 fractions aient été collectées. Pour déterminer quelle fraction présente la concentration la plus élevée de la protéine, déposer quatre microlitres de chaque fraction sur un gel SDS-PAGE et réaliser une coloration au Kamasi.Suivant les procédures standard, combiner les fractions les plus concentrées et ajouter 500 microlitres à un filtre nano step de taille de pore de 10 kilodaltons préalablement rincé avec du tampon éluant. Concentrer la protéine par centrifugation à 16 000 ×g pendant cinq minutes. Jeter le tampon, remuer la fraction protéique restante et ajouter à nouveau 500 microlitres au filtre centrifuge.À nouveau, répétez pour toutes les fractions sélectionnées. Ensuite, amenez le volume final de la protéine concentrée à environ 50 microlitres avec du tampon d'élution. Puis, tout en agitant doucement à l’aide d’une micropipette prélevée à la surface du filtre, faites passer le produit successivement sur des colonnes d’échange ionique et de filtration sur gel afin d’obtenir une protéine très pure, puis déterminez la concentration finale en protéine.Ensuite, marquer les molécules de cargaison avec un colorant organique réactif auxiliaire en excès, tel que l’Alexa 555 ou l’Alexa 647 maïde. Cette étape est nécessaire car la fluorescence verte intrinsèque de la GFP ne peut pas être utilisée pour l’imagerie de molécules uniques lors du transport nucléaire en raison de sa faible photostabilité et de son spectre qui se superpose à la fluorescence autofluorescente de la cellule. La protéine marquée doit être divisée en plusieurs fractions de 25 microlitres et conservée à moins 80 degrés Celsius un jour avant les expériences. Placer une lame de couverture stérilisée au autoclave dans une boîte de Pétri stérile de 35 millimètres et ajouter neuf millilitres de DMEM à l’aide d’une pipette.Ensuite, pipetez un millilitre de culture cellulaire et déposez-le uniformément sur le lamelle que les cellules utilisaient. Ces dernières avaient été précédemment modifiées génétiquement pour exprimer une protéine membranaire pauvre marquée par la GFP. POM 1 21, placez les boîtes dans l'incubateur à dioxyde de carbone pendant 12 heures.Le jour de l'expérience, commencez par préparer les chambres d'écoulement. Ensuite, retirez le talon de notre lame recouverte de cellules de l'incubateur, faites sécher la lame, puis fixez-la à l'aide de colle en graisse sous vide. Dans un cadre en aluminium usiné maison, il est essentiel de veiller à ce que les cellules ne s'assèchent pas pendant la préparation.À l’aide d’une seringue en plastique de 10 millilitres, ajouter deux traits de silicone sur les deux côtés d’un couvre-objet à l’aide de pinces. Prendre le petit couvre-objet préparé avec les deux traits de silicone et le placer, retourné, au-dessus de la lame recouverte de cellules, puis appuyer légèrement pour former la chambre d’écoulement. Si deux chambres distinctes sont préparées sur une même lame recouverte de cellules, il est essentiel de s’assurer d’un bon scellement afin d’éviter toute contamination croisée.Appliquez donc plusieurs lignes de graisse de silicone entre les chambres, du haut vers le bas de la lame, afin de les isoler hermétiquement. Placez également plusieurs lignes de graisse sur les côtés extérieurs des chambres. Ajoutez du DMEM dans la chambre d'écoulement pour éviter que les cellules ne se dessèchent.Ensuite, à l’aide d’un coton-tige, laver le fond de la lame deux fois avec de l’eau, puis deux fois avec de l’éthanol à 100 %. Monter le dispositif sur le microscope. Laver deux fois avec 25 microlitres de tampon de transport en l’ajoutant à la chambre d’écoulement et en l’aspirant.À l’aide d’un petit morceau de papier filtre appliqué sur le côté de sortie, faire pénétrer les cellules une fois pendant environ deux minutes avec 25 microlitres de digitonine ; la perméabilisation doit être surveillée en temps réel en utilisant le champ clair. Enfin, laver les cellules avec 25 microlitres de tampon de transport, enrichi avec 1,5 % de pyrrolidone de polyvinyle ou PVP afin d’éviter un gonflement osmotique des noyaux. Placer les cellules perméabilisées sur le microscope et identifier un anneau fluorescent vert vif.Ensuite, focalisez-vous sur l'équateur de la cellule et capturez une image avant d'ajouter les molécules de cargo fluorescentes. Éliminez toute autofluorescence en sélectionnant la région de l'enveloppe nucléaire et en illuminant avec le laser hélium-néon de 633 nanomètres jusqu'à ce qu'elle soit complètement photoblanchie. Généralement, plus de deux minutes sont nécessaires.Ajouter l'échantillon de dextran marqué, dilué dans le tampon de transport contenant 1,5 % de PVP, dans la chambre d'écoulement en un volume de 25 microlitres, puis faire circuler le liquide dans la chambre à l’aide d’une mèche en papier filtre. Il convient de faire preuve de précaution lors de l’ajout des protéines cargo d’importation et des cellules perméabilisées, car le foyer peut facilement être perturbé par tout mouvement brusque. Activer le coupeur optique à environ cinq hertz afin d’éviter le photoblanchiment et permettre à une nouvelle fraction de molécules uniques non photoblanchies de s’approcher de l’enveloppe nucléaire.Une série de vidéos de translocation de molécules uniques doit être acquise dès que les molécules d'échantillon sont ajoutées, afin que la translocation à travers les complexes de pores nucléaires puisse être capturée. Utilisez le laser à hélium-néon de 633 nanomètres pour illuminer les trajectoires de transport des molécules en translocation, effectuée correctement. Ce protocole permet la collecte d'une série d'images démontrant la translocation de molécules de cargo uniques interagissant avec le complexe de pore nucléaire.Dans des cellules perméabilisées, il est possible d'observer le passage de molécules de dextran marquées par fluorescence. En suivant les trajectoires spatiales de molécules individuelles de dextran en transit, les étapes fines de la diffusion à travers l'enveloppe nucléaire peuvent être distinguées. Un événement allant du cytoplasme au noyau est montré ici, dans lequel une molécule unique de dextran, représentée par un point rouge, part du cytoplasme, interagit avec l'enveloppe nucléaire, représentée par une ligne de pixels verts, puis termine dans le noyau.La molécule de dextrane est partie du cytoplasme, a interagi avec l'enveloppe nucléaire, puis est retournée dans le cytoplasme. Dans cet exemple, la molécule de dextrane est partie du noyau, a interagi avec l'enveloppe nucléaire et est retournée dans le noyau. Et ici, la molécule de dextrane est partie du noyau, a interagi avec l'enveloppe nucléaire et s'est terminée dans le cytoplasme.En suivant les trajectoires spatiales de molécules individuelles de dextran traversant la membrane, il est possible de distinguer les étapes fines de la diffusion à travers l'enveloppe nucléaire. Les trajectoires de l'événement représentées par des lignes bleues et des points creux ont été déterminées et superposées à l'enveloppe nucléaire, indiquée par une ligne noire. Les lignes verte et rouge représentent une distance de 100 nanomètres par rapport à l'enveloppe nucléaire, respectivement du côté cytoplasmique et du côté nucléaire.Nous venons de vous montrer comment visualiser la translocation de molécules uniques à travers le complexe du pore nucléaire avec une résolution de 10 nanomètres à 400 microsecondes. Lors de cette procédure, il est important de garder à l'esprit la nécessité d'obtenir un rapport signal/bruit maximal et de faire preuve de la plus grande prudence lors de l'expérience sur une molécule unique, car le focus peut facilement être perturbé. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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