Une technique de la fenêtre mince crâne pour chronique à deux photons In vivo de Murine microglies dans les modèles de la neuro-inflammation

Chez les patients adultes infectés par le VIH, la neuroinflammation interfère avec la signalisation synaptique normale, entraînant des déficits neurocognitifs incluant des difficultés d'abstraction, de fluidité verbale, d'attention, d'apprentissage, de traitement de l'information nouvelle et de mémoire. La protéine Tat du VIH induit la sécrétion de molécules inflammatoires, qui peuvent imiter le dysfonctionnement synaptique observé chez les patients infectés par le VIH. Des souris adultes exprimant la GFP dans les cellules mononucléées, y compris les microglies, sont utilisées pour étudier la neuroinflammation induite par la protéine Tat du VIH à l'aide de la microscopie à deux photons avec crâne mince.

Les réponses des microglies suite à l'injection de la protéine Tat peuvent être visualisées in vivo. Les images obtenues montrent un raccourcissement et un épaississement des prolongements microgliaux, la formation de structures en forme de cupule phagocytaire, ainsi que la migration de monocytes périphériques dans les microvaisseaux cérébraux. Bonjour, je suis Dan Marker du laboratoire de Harris Galbard et du Centre pour le développement neural et les maladies à l'Université de Rochester.

Bonjour, je suis EF Trombley du laboratoire d'Esca, du département de neurobiologie et d'anatomie à l'Université de Rochester. Bonjour, je suis Shain Luu, également du laboratoire Albas. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'imagerie à deux photons utilisant une préparation à crâne mince.

Nous utilisons cette procédure pour étudier la neuroinflammation chronique. Commençons donc par l'expérience présentée ici. Des OT exprimant la GFP dans les lignées cellulaires mononucléées, y compris les microglies, sont utilisées.

Différentes souches de souris peuvent être utilisées pour répondre aux besoins d'un projet spécifique. Commencez par préparer une souris anesthésiée avec un mélange de fentanyl et de midazolam pour une intervention chirurgicale. Tout d'abord, assurez-vous que l'animal ne réagit plus à des stimuli douloureux, tels qu'une pincée de la queue.

Placer l'animal sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie post-anesthésique. Ensuite, recouvrir les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique protectrice afin de maintenir les yeux humides. Tous les instruments chirurgicaux doivent avoir été stérilisés au autoclave ou à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre ; désinfecter en outre les instruments en les faisant tremper dans de l’éthanol à 70 %.

À l’aide de ciseaux, raser les poils du cuir chevelu de l’animal, puis désinfecter la zone avec une solution de povidone-iode à 10 % et de l’éthanol à 70 %. Commencer la chirurgie en utilisant de petits ciseaux pour pratiquer une incision médiane dans le cuir chevelu, en partant de quatre à cinq millimètres en arrière du crâne et en progressant vers l’avant des yeux. Cette incision doit être suffisamment longue pour que la peau n’entrave pas le collage de la plaque qui stabilise la tête de la souris durant l’imagerie à deux photons.

Ensuite, appliquez de l'éthanol à 100 % sur le coton stérile pour sécher les membranes situées au-dessus du crâne. Retirez-les délicatement à l’aide de pinces fines. Si les membranes ne sont pas retirées, la fixation de la plaque crânienne sera instable.

Sous un microscope stéréo, identifier la zone à amincir. Éviter les zones d'intérêt situées directement au-dessus des sutures crâniennes, car le crâne est moins stable dans ces régions et les vaisseaux sanguins et méninges sous-jacents interféreront avec l'imagerie transmise à la fenêtre d'observation de la zone d'intérêt. Ensuite, à l’aide d’un coton-tige, essuyer à nouveau le crâne en utilisant une solution à 10 % de chlorure de fer.

Appliquez une fine couche de colle perma bond, neuf 10, autour des bords de la fenêtre d'observation située sous la plaque crânienne. Ensuite, placez délicatement la plaque sur la zone d'intérêt du crâne de l'animal en exerçant une légère pression pour fixer la colle. Appliquez une petite quantité d'acrylique autour du bord de la fenêtre d'observation à l’aide d’une seringue.

Enfin, appliquer une petite quantité de Tite 4 54 sur les bords de la fenêtre d'observation afin d'éviter les fuites. Visser la plaque crânienne sur le support de l'animal et vérifier la stabilité sous un microscope stéréo en sondant délicatement avec une paire de forceps : il ne doit y avoir aucun mouvement du crâne par rapport à la plaque crânienne.

Déposer une goutte de solution saline sur la fenêtre d’observation pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuites en prévision de l’amincissement. Sécher le crâne à l’aide d’une combinaison de cotons-tiges stériles et d’air comprimé. Amincir le crâne à l’aide d’un foret IRF 0 0 7 monté sur une micro-perceuse.

À 4 000 tr/min. Commencez très doucement à amincir une zone circulaire de deux à 2,5 millimètres de diamètre. Utilisez uniquement de légers mouvements de balayage presque parallèles au crâne.

Ne pas exercer de pression directe vers le bas. Interrompre le perçage toutes les 20 à 30 secondes pour éliminer la poussière osseuse à l’aide d’air comprimé. Ces pauses permettent au crâne de se refroidir afin d’éviter tout dommage thermique au tissu cérébral sous-jacent.

Au fur et à mesure que le perçage progresse, observez la transition vers la couche osseuse plus humide et épineuse appelée diploé. Une fois cette couche atteinte, manipulez le foret avec une prudence accrue. Vérifiez de temps en temps l'épaisseur du crâne en plaçant du sérum physiologique sur la zone mince et en examinant au microscope stéréoscopique.

La salive permettra une dissipation accrue de la chaleur. À mesure que le crâne s'amincit, les plus petits vaisseaux sanguins deviennent visibles. Utilisez une micro-lame dentaire pour réaliser l'amincissement final sous salive.

Le microcouteau procure beaucoup plus de rétroaction tactile concernant la stabilité du crâne. Cela permet d'obtenir des préparations beaucoup plus minces qu'avec la fraise seule. L'épaisseur optimale du crâne pour l'imagerie se situe entre 10 et 30 micromètres.

Le processus d'amincissement prend généralement entre 15 et 30 minutes. Vérifiez plusieurs fois l'épaisseur du crâne en fluorescence épi pendant la réalisation d'une fenêtre crânienne mince. La netteté et la profondeur des microglies et du réseau vasculaire visibles indiquent bien le moment où la fenêtre est prête pour l'imagerie.

Une fois la fenêtre prête, utilisez une pipette en verre d'un millimètre de diamètre pour déposer une petite goutte de colle acrylique Cy sur la zone du crâne mince et abaissez délicatement un morceau de lame couvre-objet dessus. Appuyez ensuite doucement contre le crâne afin d'expulser tout excès de colle, en évitant la formation de bulles entre celle-ci et la lame couvre-objet, car elles pourraient obstruer la vue. Une fois la colle sèche, utilisez une microlame pour retirer soigneusement toute la colle restante sur le dessus de la lame couvre-objet, en prévision d'une imagerie à deux photons.

Couvrez la fenêtre corticale crânienne mince avec une solution saline et localisez la région d’intérêt en fluorescence épi. Pour permettre les imageries ultérieures de cette région, prenez une photo à l’aide d’un appareil photographique dédié à l’imagerie. Ici, un microscope personnalisé à deux objectifs équipés d’un laser à saphir titane réglé à 920 nanomètres est utilisé.

La fluorescence est détectée à l'aide d'un tube photomultiplicateur ou PMT en mode de détection sur tout le champ et d'un filtre d'émission 5 81 80. Une lentille à immersion dans l'eau de 20 x est utilisée tout au long de la session d'imagerie. Réglez la puissance maximale du laser de l'objectif entre 50 et 65 milliwatts.

Ensuite, sélectionnez une zone d'intérêt, soit la couche corticale une, soit deux, jusqu'à 150 micromètres sous la surface de l'écorce. Pour faciliter la réimagerie, prenez des images du même champ de vision avec un zoom numérique à 1 x, 2 x et 3 x. Les vaisseaux sanguins peuvent servir de repères pour retrouver facilement le même champ de vision lors des séances d'imagerie ultérieures.

Avec un grossissement de trois x, acquérez plusieurs Zacks avec 80 à 90 pas Z chacun et un pas de 0,69 micromètre toutes les cinq minutes pendant une durée maximale de 30 minutes. Cela permet un bon échantillonnage de la morphologie et du comportement microglial au fil du temps entre les acquisitions de Zacks. Vérifiez le niveau de solution saline et la profondeur de l’anesthésie. Si nécessaire, une dose de rappel équivalente au tiers de la dose initiale du cocktail anesthésique peut être administrée pendant la procédure afin d’éviter le dépôt de tat sur la seringue et l’aiguille durant les jours précédant l’injection.

Enduisez la doublure interne d'une aiguille de calibre 35 et d'une seringue microvolume de 10 microlitres en aspirant la solution d'ajustement jusqu'à ce qu'elle remplisse à la fois l'aiguille et la seringue. Laissez la solution reposer pendant cinq minutes à température ambiante, puis videz la solution de la seringue, retirez le piston et laissez sécher complètement la seringue et l'aiguille. Enfin, rincez soigneusement la seringue et l'aiguille avec de l'eau déionisée.

Une fois silanisé, un syringe et une aiguille peuvent être utilisés pendant plus de six mois avant qu'un retraitement ne soit nécessaire. Le jour de l'injection, déposez une petite goutte de la solution TAT sur une lame de verre silanisée. À l'aide d'une pipette à embout silanisé, chargez la quantité souhaitée de solution dans la seringue à volume micro à partir de cette goutte.

À l’aide d’un foret, réalisez une petite craniotomie de 0,5 millimètre de diamètre, située soit à trois millimètres au rostral, soit au latéral de la fenêtre corticale de crâne mince où des images à deux photons ont été obtenues. Pour ce faire, amincissez soigneusement le crâne, puis utilisez une pince fine et pointue pour retirer la fine couche osseuse.

Utilisez un micromanipulateur pour aligner l'aiguille calibrée de 35 et la seringue avec la craniotomie. Ensuite, faites avancer délicatement l'aiguille à une profondeur de 700 à 900 micromètres sous la surface de la pellicule. Injectez trois microlitres à raison de 80 nanolitres par minute à l'aide d'une pompe à seringue contrôlée par microprocesseur.

Cette figure montre des microglies marquées par la GFP visualisées par imagerie à deux photons après l'implantation d'une fenêtre corticale à crâne mince, située à environ 50 micromètres sous la surface de l'écorce. Les sections uniques obtenues en deux photons au jour zéro, de 15 à 30 minutes après l'implantation de la fenêtre corticale à crâne mince, ainsi que celles réalisées sept et 17 jours plus tard, démontrent que les fenêtres restent transparentes tandis que les microglies demeurent activées en l'absence de lésions inflammatoires. Cela souligne l'utilité de cette méthode pour étudier à la fois les interactions normales et inflammatoires entre les cellules immunitaires effectrices et les autres types cellulaires neuronaux.

In vivo, les projections Z prises à six et 24 heures après l'injection de la neurotoxine VIH TAT présentent des modifications morphologiques marquées des microglies activées. Cela démontre davantage notre capacité à étudier en temps réel les changements morphologiques des microglies dans des modèles aigus et chroniques d'inflammation neurologique. Nous venons de vous montrer comment préparer une fenêtre de crâne mince et comment l'utiliser pour étudier l'inflammation neurologique lors de cette procédure.

Il est important de se rappeler de prendre son temps lors de la manipulation du crâne afin d'éviter tout dommage causé par la préparation elle-même. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.