Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

Cette procédure utilise l'imagerie de cellules vivantes pour visualiser le transfert du VIH marqué avec la GFP à travers les synapses virologiques entre les cellules T CAT exprimant le VIH et des cellules T primaires non infectées. Le test de transfert cellule à cellule commence par la transfection des cellules T CAT avec le VIH gag IG FP, un clone infectieux et fluorescent du VIH-1. Les cellules T CAT transfectées exprimant le VIH gag IG FP sont ensuite mélangées à des cellules T primaires non infectées marquées au C-M-T-M-R et chargées dans une chambre d'imagerie, où le transfert du VIH marqué avec la GFP à travers la synapse virologique peut être observé.

Les données obtenues sont analysées à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images afin de révéler les détails du transfert du VIH à travers les synapses virologiques des cellules T. Bonjour, je m'appelle Benjamin Dale du laboratoire de Ben Chen, Département de médecine à la Mount Sinai School of Medicine. Je m'appelle Greg McNerney, rattaché au laboratoire du Dr Thomas Huser au Centre NSF pour la biophotonique au centre médical uc Davis.

Et je suis Deanna Thompson, également du laboratoire du Dr Thomas Huser. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de visualiser le transfert cellule à cellule du VIH-1 à l'aide de la microscopie confocale en temps réel. Dans cette procédure, les cellules Jurkat sont transfectées avec un clone moléculaire infectieux du VIH, uniquement par du personnel de laboratoire qualifié travaillant dans un laboratoire agréé en biosécurité.

Des salles de culture de tissus de niveau deux plus ou de niveau de sécurité biologique trois peuvent réaliser le protocole décrit ici. Le travail avec le VIH infectieux dans les installations d'imagerie doit être approuvé par le bureau local de sécurité biologique de l'établissement. Maintenir les cellules jerk cat destinées à être utilisées comme cellules donneuses à une concentration comprise entre deux fois dix puissance cinq et huit fois dix puissance cinq cellules par millilitre.

Dans la culture de cellules jerk cat, une concentration cellulaire en milieu dépassant huit fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre entraîne une réduction de l'efficacité de transfection. Pour commencer la procédure, transfecter cinq fois 10 à la puissance six cellules jerk cat avec le plasmide viral HIV gag IGFP en utilisant la méthode d'électroporation amax nucleo, telle que décrite dans le protocole écrit accompagnant. Laisser les cellules se récupérer toute la nuit. Les cellules mononucléées du sang périphérique sont purifiées à partir de couches buffy de sang humain total par centrifugation en gradient de densité FICO.

Les lymphocytes T CD4 positifs primaires sont purifiés à partir des cellules mononucléées du sang périphérique par sélection négative à l'aide d'un kit d'isolement des lymphocytes T CD4 positifs. Les lymphocytes T CD4 positifs sélectionnés négativement sont récupérés à partir d'une colonne magnétique et cultivés dans notre milieu PMI contenant 10 % de FPS, supplémenté avec 10 unités par millilitre d'IL-2 humaine recombinante. On peut également aliquoter les lymphocytes T CD4 positifs primaires isolés et les congeler à l'aide de récipients cryogéniques. Les récipients de congélation sont placés dans un congélateur à moins 70 degrés Celsius pendant un minimum de trois à quatre heures.

Les cellules sont ensuite transférées dans de l'azote liquide pour une conservation à long terme. Maintenant que les cellules jerk head ont été transfectées et que les cellules T primaires ciblées CD4 positives ont été isolées, passez au nettoyage et à l'étiquetage des cellules le jour suivant la transfection. Les cellules jerk expriment désormais le vecteur infectieux de VIH fluorescent.

Lorsque l'on manipule des échantillons infectieux, nous portons une blouse de laboratoire fermée sur le devant et deux paires de gants. Éliminer les débris cellulaires des cellules transfectées par centrifugation sur un milieu de densité élevée fial pack. Commencer par distribuer 1,5 millilitre de fial pack au fond d'un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, recouvrez délicatement le matériau en gradient avec les cellules transfectées jerk hat dans un volume de cinq millilitres de notre milieu PMI. À ce stade, les cellules transfectées jerk hat sont capables de produire du VIH infectieux. Par conséquent, toutes les pointes de pipette ayant été en contact avec les cellules exprimant le VIH doivent être désinfectées à l’aide d’une solution d’eau de Javel à 10 %.

Avant de jeter dans un récipient placé dans la cabine de sécurité biologique, boucher le tube et pulvériser l'extérieur du tube avec une solution d'éthanol à 70 %, puis essuyer avec un chiffon sec. Centrifuger les cellules à 400 G pendant 20 minutes à température ambiante sans frein. Après la centrifugation, utiliser une pipette pour retirer soigneusement les cellules de l'interface avec le milieu et transférer les cellules dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Diluer les cellules avec notre milieu PMI jusqu'à un volume total de 15 millilitres et centrifuger à 300 G pendant 10 minutes.

À température ambiante, nous suspendons le culot dans trois millilitres de milieu de culture jerk hat et transférons dans une cavité de deux centimètres d'une plaque de six puits. Placer la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire jusqu'au lendemain, moment où elle sera prête à être utilisée. Le soir même, étiqueter les lymphocytes T primaires CD4 positifs utilisés comme cellules cibles afin de les distinguer des cellules du donneur. Premièrement, centrifuger quatre fois 10⁶ des lymphocytes T primaires CD4 positifs à 400 ×g pendant 10 minutes.

Ensuite, lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS et resuspendez-les dans deux millilitres de PBS. Ajoutez le traceur cellulaire orange à une concentration finale de 1,5 micromolaire et incubez à 37 degrés Celsius pendant plusieurs minutes. Une fois l'incubation terminée, ajoutez huit millilitres de milieu Chica complet et centrifugez à 400 ×g pendant 10 minutes.

Ré-suspendez les cellules dans trois millilitres de milieu complet supplémenté avec 10 unités par millilitre d'IL-2 et placez-les dans l'incubateur de culture tissulaire pendant la nuit. Après l'incubation nocturne, les cellules donneuses et les cellules cibles sont prêtes pour l'expérience de transfert cellule à cellule. Avant de mettre en place l'expérience de transfert cellule à cellule, préparez la chambre d'imagerie afin d'atténuer les fluctuations de température ambiante sur la plateforme.

Pour bloquer la lumière ambiante de la pièce, une grande housse noire est placée sur l'ensemble du dispositif de chauffage du microscope, créant une poche d'air isolée autour du système. La chambre d'observation est maintenue à une température stable de 37 degrés Celsius à l'aide d'un chauffage thermostaté équipé d'une sonde thermocouple de type T positionnée à côté de l'échantillon pour un contrôle en boucle fermée de la température. Préchauffer pendant 30 minutes avant de monter l'échantillon.

L'imagerie confocale à disque tournant avec un microscope optique inversé est utilisée pour créer des images confocales 3D du transfert de cellule à cellule du VIH. Tous les composants matériels et l'acquisition, y compris une platine Z, sont contrôlés par le logiciel MetaMorph ou MetaMorph IQ version 1.8. La numérisation est effectuée par une unité confocale à disque tournant CSU-10 qui utilise simultanément plus de 800 points confocaux, augmentant ainsi considérablement la vitesse de balayage pour accompagner sa rapidité. Le CSU-10 est couplé à une caméra CCD à multiplication électronique très sensible, permettant une imagerie rapide en faible luminosité, ce qui réduit à la fois le photoblanchiment et la phototoxicité.

La source de lumière fluorescente est un laser à gaz ionique argon-krypton à multiples longueurs d'onde. Un filtre optique accordable And or Oko ou A OTF est utilisé pour sélectionner les longueurs d'onde souhaitées, ici 488 nanomètres et 568 nanomètres, tout en contrôlant leur puissance afin de réduire davantage le photoblanchiment et d'allonger la durée d'acquisition d'images. L'A OTF obture rapidement le laser après chaque exposition de 15 à 30 millisecondes, lorsque la caméra n'acquiert pas d'images, évitant ainsi une exposition inutile pendant le transfert des images de la caméra E-M-C-C-D vers l'ordinateur.

La lumière laser est intégrée au système de disque tournant à l’aide d’un miroir dichroïque quadruple bande 405 488 568 647. L’émission fluorescente est séparée par longueur d’onde à l’aide d’un miroir dichroïque longue passe de 560 nanomètres équipé d’un séparateur d’image. Le canal vert est filtré à l’aide d’un filtre passe-bande de 525/50 nanomètres et le canal rouge est filtré à l’aide d’un filtre passe-bande de 609/54 nanomètres. Les deux canaux sont projetés côte à côte sur la caméra E-M-CC-D.

Pendant que la chambre d'imagerie atteint sa température de fonctionnement, préparez les cellules pour l'expérience de transfert de cellule à cellule. Utilisez un cytomètre hématique pour dénombrer les cellules exprimant HIV gag IGFP. Placez le cytomètre hématique dans une boîte de Pétri afin d'éviter toute exposition directe aux cellules exprimant le virus.

Lavez les cellules avec un milieu indépendant du dioxyde de carbone et resuspendez-les dans un milieu d'imagerie de cellules vivantes à une concentration de un à trois fois 10⁷ cellules par millilitre. L'utilisation d'un milieu indépendant du dioxyde de carbone élimine la nécessité d'une chambre environnementale au dioxyde de carbone. Pour l'imagerie.

Les cellules comptent également, lavent et resuspendent les lymphocytes T primaires marqués CD4 positifs comme vient de l'être montré pour les cellules Dur hat. Ensuite, initier le transfert cellule à cellule en mélangeant 20 microlitres de cellules Dur hat transfectées par HIV gag IGFP avec 40 microlitres de lymphocytes T primaires marqués CD4 positifs, puis charger 50 microlitres dans une chambre micro EBD traitée pour culture tissulaire et perméable aux gaz. Sceller la chambre avec des bouchons et fixer les bouchons en enveloppant l'interface chambre-bouchon EBIT D avec du paraforme.

Essuyez la chambre d'imagerie avec un chiffon chimique imprégné d'éthanol à 70 % et laissez-la sécher brièvement à l'air dans la hotte. Transportez la chambre d'imagerie scellée dans un récipient fermé afin d'éviter toute exposition accidentelle. Si la chambre venait à tomber pendant le transport juste après le chargement de la chambre d'imagerie IBD avec des cellules, fixez l'appareil sur le microscope.

Prenez des images de paires de cellules à l’aide d’un objectif à immersion huile de 60 x 1,42 NA, car une ouverture numérique élevée améliore considérablement la résolution et permet de maximiser la vitesse d’acquisition des piles d’images 3D. Réduisez la zone d’enregistrement de la caméra du CD EM à la région immédiate d’une paire de cellules. En outre, un grand pas en Z compris entre 0,45 et 0,75 micromètre peut également accélérer l’acquisition dans ces conditions.

Des images sont enregistrées en continu à des intervalles de 20 à 60 minutes. L'imagerie répétée du même emplacement de l'échantillon peut s'étendre jusqu'à six heures avec un photoblanchiment minimal lorsqu'elle est effectuée. Chaque segment de données comprend des dizaines de milliers d'images pouvant occuper un volume total de cinq à 20 gigaoctets.

Pour faciliter le transport et l'analyse des fichiers volumineux, chaque fichier est divisé et exporté sous forme de segments d'image TIFF d'un gigaoctet. Pour analyser les images acquises, utilisez l'un des nombreux logiciels d'analyse d'images. Reportez-vous au protocole écrit accompagnant pour les détails concernant l'analyse des images, notamment la correction de la décantation d'intensité et le suivi automatique et manuel des points gag.

Entre 10 et 15 minutes après le mélange, on peut visualiser des cellules de chat exprimant HIV gag IGFP adhérant à des cellules T primaires positives pour le CD4 lors de l'imagerie. À partir de ces conjugués, on peut évaluer les mouvements des points de gag dans les cellules infectées ainsi que dans les cellules cibles. Après la synapse, entre 30 minutes et trois heures, on peut observer un déplacement des points de gag IGFP vers les cellules cibles marquées au traceur cellulaire.

Nous venons de vous montrer comment visualiser le transfert de l'agent du VIH d'une cellule à l'autre entre les lymphocytes T. Lors de la réalisation de ces procédures, il est très important de respecter scrupuleusement toutes les précautions de niveau de biosécurité 2+ ou de niveau de biosécurité 3 lors de la manipulation d'échantillons ayant été exposés à des cellules exprimant le VIH. Pensez également à utiliser des cellules JCA bien entretenues et de l'ADN sans endotoxines afin d'optimiser la transfection.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.