Name: Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Découvrez la visualisation du transfert du VIH entre cellules T par microscopie confocale en temps réel. Cette méthode utilise des clones fluorescents pour observer la transmission virale et contribue à la compréhension de la pathogenèse du VIH.

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Cet examen a été soutenue par les Instituts nationaux de subventions de la santé, AI074420-02, le Prix Burroughs Wellcome chercheur, bourses de carrière Hirschl à BKC et par le Centre de la NSF pour la biophotonique Sciences et Technologie, l&#39;accord de coopération PHY012099, et un système de santé UCD bourse de recherche à TH UCD CNTC NCRR ULRR024146.

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al Sciences 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Aperçu De cellule à cellule propagation du VIH a été initialement décrite en utilisant des cellules Jurkat infectées au VIH que les cellules du donneur et de cellules CD4 + primaires lymphocytes T comme les cellules d&#39;accepteur 1,2,3. Dans ces études, le virus a été détecté dans les cellules fixes utilisant une coloration d&#39;anticorps. Pour suivre le transfert de virus de cellule à cellule dans les cellules vivantes, nous exploitons un recombinant, clone moléculaire infectieux du VIH appelé VIH Gag-iGFP 4. Il porte la protéine fluorescente verte (GFP) inséré en interne en la protéine Gag entre les domaines MA et CA. Ce clone moléculaire infectieux du VIH conserve sans la nécessité d&#39;un virus assistant. Les particules virales à partir de ce clone sont stoechiométriquement chargé avec la protéine fluorescente verte, fournissant un signal fort de fluorescence pour surveiller l&#39;assemblage viral et de transfert entre cellules. Lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec la cellule de suivi des inertes colorants fluorescents, les cellules réceptrices peuvent être discriminés à partir des cellules du donneur d&#39;entrée, et permettant de visualiser le transfert du VIH d&#39;une cellule T infectée à une cellule T non infectées 5. La formation des synapses virologiques et le transfert de virus d&#39;une cellule à l&#39;autre peut alors être observé dans les cellules vivantes alors qu&#39;elles sont cultivées dans un récipient hermétique, perméable aux gaz de chambre d&#39;imagerie. (Jour 1) 2. Préparation du VIH Gag-iGFP transfectées cellules Jurkat T <ol><li> Préparer le CD4 + humains T lignée cellulaire Jurkat (ATCC, Manassas, VA) en prenant soin de maintenir les cellules à une concentration comprise entre 2 x 10 5 et 8 x 10 5 cellules / ml dans Jurkat milieux de culture (RPMI 1640, 10% de sérum de veau fœtal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine). La clé du succès: la culture des cellules Jurkat à des concentrations supérieures à 8 x 10 5 cellules / mL se traduira par une réduction de l&#39;efficacité de la transfection. Note: La transfection du VIH Gag-iGFP ADN proviral dans les cellules T, comme décrit ci-dessous, les résultats dans la production d&#39;une compétents pour la réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaine. En tant que tel, toutes les procédures doivent être entrepris que par le personnel de laboratoire formé de certification du niveau de biosécurité 2 + ou du niveau de biosécurité 3 (BL2 + / BL3) chambres de culture de tissus. Travailler avec infectieuses VIH dans les établissements d&#39;imagerie doit être approuvé par le bureau de biosécurité institutionnel local. </li><li> Transfecter les Jurkats avec le plasmide virale, le VIH-Gag iGFP en utilisant la méthode nucléofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 cellules par centrifugation pendant 10 min à 150 x g. Aspirer le surnageant et laver les cellules dans une solution saline tamponnée phosphate stérile (PBS). Centrifuger les cellules et resuspendre le culot à 97 ul de pré-chauffé, V solution contenant Nucleofector compléter le fabricant. Ajoutez trois uL d&#39;endotoxine libre VIH Gag-iGFP plasmide (1 ug / uL) à la suspension cellulaire et mélanger doucement. Transférer la suspension cellulaire à une cuvette et nucleofect utilisant le programme S-18. Immédiatement transférer les cellules à 3 mL de milieu de culture préchauffé Jurkat sans antibiotiques. </li><li> Pour préparer les cellules CD4 + cibles pour les synapses virologiques, on obtient des cellules mononucléées du sang périphérique de buffy coats en utilisant un standard Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suède) du protocole. Lymphocytes T CD4 + sont ensuite sélectionnés négativement utilisant un kit d&#39;isolation par billes magnétiques (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Elles peuvent être stockées cryogéniquement dans N2 liquide dans des aliquotes de 5 x 10 6 cells/500 ul de milieux de congélation (90% de veau fœtal serum/10% de DMSO). Décongelé CD4 + primaires des cellules T sont cultivées dans du RPMI 10% SVF, supplémenté avec 10 unités / ml d&#39;IL-2. </li></ol> (Jour 2) 3. Récupération à partir de cellules vivantes avec le VIH Jurkats transfectées Gag-iGFP et la coloration des cellules cibles avec des colorants fluorescents <ol><li> Laisser les cellules Jurkat à se remettre de la transfection nuit. Puis éliminer les débris cellulaires par centrifugation sur un matériau hypaque ficoll gradient de densité. Distribuer 1,5 ml de Ficoll-Paque au fond d&#39;un tube de 15 ml conique. Doucement superposition ce matériel dégradé avec l&#39;Jurkats transfectées dans un volume de 5 mL de RPMI. Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 20 min à température ambiante avec le frein off. Retirez délicatement les cellules de l&#39;interface médias / Ficoll à l&#39;aide d&#39;une pipette. Les transférer à un nouveau 15 ml tube conique. Diluer les cellules avec IPMB à un volume total de 15 ml et centrifuger à 300 xg pendant 10 min. Reprendre le culot dans 3 mL de milieu de culture dans un Jurkat 2 cm et (6-même plaque) et le retour des cellules à l&#39;incubateur de culture tissulaire. </li><li> Afin de distinguer les cellules cibles à partir des cellules du donneur dans les expériences de transfert de cellule à cellule, nous prelabel les cellules CD4 + cibles avec des colorants fluorescents. CD4 + primaires des cellules T sont étiquetés de la mêmeING avant utilisation. Nous avons eu d&#39;excellentes cellules T étiquetage succès avec les deux CellTracker et colorants CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alors que la concentration de colorant et les temps d&#39;incubation doit être optimisée en fonction du colorant particulier et le type cellulaire utilisé, un protocole représentatives suit. Pellet 4 x 10 6 cellules CD4 + primaires T par rotation à 400 xg pendant 10 min. Laver les cellules avec 5 ml de PBS et de remettre en suspension dans 2 mL de PBS. Ajouter CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) à une concentration finale de 1,5 uM et incuber à 37 ° C pendant 20 min. Ajouter 8 ml de milieu complet et Jurkat centrifuger à 400 xg pendant 10 min. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu complet supplémenté avec 10 unités / ml d&#39;IL-2 et le placer dans l&#39;incubateur de culture tissulaire pendant la nuit. </li></ol> (Jour 3) 4. Surveillance de cellule à cellule de transfert du VIH Gag-iGFP utilisant imagerie de cellules vivantes Nous utilisons régulièrement le VIH Gag-iGFP cellules Jurkat transfectées 48 heures post-transfection. Cependant, nous avons utilisé avec succès des cellules dès 24 heures, et au plus tard 72 heures après transfection. <ol><li> Environ 48 heures après la transfection, le VIH-Gag iGFP Jurkats exprimer sont comptés, lavés avec du CO 2-médias indépendants (Invitrogen, Carlsbad, CA), et remis en suspension dans l&#39;imagerie cellulaire direct des médias (CO 2 médias indépendants, 10% de sérum fœtal bovin, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine, 10 unités / ml d&#39;IL-2) à une concentration de 1-3 x 10 7 cellules / ml. </li><li> De façon similaire, les laver et resuspendre étiquetés CD4 + primaires des cellules T à une concentration de 1-3 x 10 7 cellules / ml en direct des médias d&#39;imagerie cellulaire. </li><li> Mélanger le VIH Gag-iGFP transfectées avec Jurkats CD4 + primaires des cellules T à un ratio de 1:2 ou 1:3 et de la charge dans une culture tissulaire traitée, perméables au gaz, microchambre (ibidi, Vérone, WI). Par exemple, mélanger de 20 uL du VIH Gag-iGFP Jurkats transfectées avec 40 ul de étiquetés CD4 + primaires des cellules T. Charge 50 ul de ce mélange dans une chambre ibidi et sceller la chambre avec des bouchons. Fixez les bouchons en enveloppant le bouchon / interface de chambre ibidi avec du parafilm. </li></ol> 5. Considérations pour les plates-formes de microscopie: disque rotatif imagerie confocale Après le chargement d&#39;une chambre d&#39;imagerie ibidi avec les cellules, nous avons immédiatement monter l&#39;appareil sur un microscope optique inversé (iX71 Olympus, Center Valley, Pennsylvanie). La chambre ibidi devrait être transféré à la loupe seulement par le personnel de laboratoire BL2 + formés portant des vêtements de sécurité appropriés. Bien imagerie des cellules vivantes utilise couramment chambres d&#39;incubation coûteux à maintenir une stabilité à 37 ° C l&#39;environnement, ceci a été réalisé en utilisant un appareil de chauffage simple et économique thermostatique (ASI 400, Nevtek, Williamsville, Virginie) avec une pointe de T-type de thermocouple monté à côté l&#39;échantillon de rétroaction bonne température. Nous avons trouvé à l&#39;aide de CO 2-média indépendant nous permet de maintenir la viabilité des cellules de haute tout en évitant l&#39;utilisation d&#39;une chambre de CO 2. Afin d&#39;atténuer les fluctuations de température plateforme contre dans la chambre et pour bloquer la lumière ambiante de fond, un grand linceul noir est drapée sur l&#39;ensemble microscope / chauffe-setup créer une poche d&#39;air isolant autour du système. Ceci réduit considérablement les variations de température et de la dérive de l&#39;échantillon associée liés à la température, mais nécessite de pré-chauffage pendant 30 minutes avant le montage de l&#39;échantillon. 6. Acquisition de données, de transfert et de traitement d&#39;image Les images sont prises avec un objectif 60x 1,42 NA immersion dans l&#39;huile (UPlanApo N, Olympus) que l&#39;ouverture numérique élevée (NA), améliore considérablement la résolution. Pour créer des images 3D confocale, la numérisation est effectuée par une unité de disque rotatif confocale (CSU-10, Yokagawa, Japon) qui utilise simultanément&gt; 800 places confocale à augmenter considérablement la vitesse de balayage. Pour compléter sa vitesse, la CSU-10 est couplé à une très sensible électrons multipliant dispositif à couplage de charge (EMCCD, ixon + 897, Technologies Andor, Irlande) pour permettre à la caméra rapide, l&#39;imagerie de faible luminosité qui diminue à la fois photoblanchiment et de phototoxicité. La source de lumière de fluorescence est un multi-longueur d&#39;onde ARKR ions de gaz laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), où la longueur d&#39;onde désirée (488 nm) et la puissance du laser mesurée juste avant l&#39;objectif du microscope (&lt;1 mW) sont sélectionnés par un modulateur acousto- optiques filtre accordable (AOTF), (Technologies Andor). Afin de réduire davantage photoblanchiment et d&#39;étendre l&#39;imagerie en temps total, le AOTF rapidement (microsecondes) coupe le faisceau laser à chaque fois que l&#39;appareil est inactif (10-20 ms) tandis que l&#39;image nouvellement acquises est délivrée par le CCD (15-30 ms d&#39;exposition) à l&#39;ordinateur. La lumière laser est couplé au système de disque rotatif utilisant une 405/488/568/647 quadribande miroir dichroïque (Semrock, Rochester, NY). Émission de fluorescence est filtré en utilisant un filtre passe-bande 525 / 50 (Semrock) à l&#39;intérieur une roue à filtres (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) monté bntre la caméra EMCCD et l&#39;unité de disque confocale filer. Tout le matériel et l&#39;acquisition, y compris un z-scène (Mad Labs ville, Madison, WI), sont contrôlés par le Andor iQ v1.8 logiciel. Afin de maximiser la vitesse d&#39;acquisition à environ 01/02 à 01/09 secondes piles d&#39;images 3D, nous recadrer la zone d&#39;enregistrement de caméra de l&#39;EMCCD jusqu&#39;au voisinage immédiat de la cellule-paire. Par ailleurs, au détriment de certaines informations en z, un grand z-étape entre 0.45 à 0,75 um peut être utilisé pour accélérer l&#39;acquisition. Imagerie dans ces conditions, peut durer jusqu&#39;à 6 heures - en utilisant en continu de 20 à 60 segments minute - avec photoblanchiment minime. Au total, chaque segment de données occupe généralement 50 à 20 Go d&#39;espace alors que des dizaines de milliers d&#39;images sont prises. Pour faciliter le transport et l&#39;analyse des fichiers de données volumineux, chaque ensemble d&#39;acquisition doit être décomposé et exportés comme une segments TIFF Gb fichier image en utilisant l&#39;Andor iQ v1.8 logiciel. A partir de là, de nombreux logiciels sont disponibles pour une excellente analyse de l&#39;image, comme Metamorph, Volocity et ImageJ (nous vous recommandons de ses îles Fidji variation). Lorsque deux marqueurs fluorescents doivent être suivis, nous enregistrer simultanément deux d&#39;entre eux, sans ralentir l&#39;acquisition en utilisant un &quot;mode écran partagé.&quot; Les deux marqueurs sont excités par deux lignes laser ARKR à la fois (souvent 488 et 568 nm). Inséré directement devant la caméra EMCCD est une image (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) séparateur qui sépare les deux images différentes. Chaque image est ensuite filtrée de manière indépendante en utilisant des filtres de fluorescence (Semrock) et projetée côte-à-côte sur la caméra à la fois la création du &quot;split-screen&quot; en vigueur. Ce serait alors besoin de culture manuelle et l&#39;alignement des images plus tard dans le traitement d&#39;image. 7. Considérations de traitement d&#39;image et analyse de données Nous généralement effectuer une analyse d&#39;image avec Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) sur les ordinateurs Macintosh (Apple, Inc.) Filature des images de disque laser, microscopie confocale sont d&#39;abord ajustées dans leur intensité pour corriger photoblanchiment, puis déconvoluées avec Volocity. Mesures de l&#39;intensité et le suivi des points lacrymaux Gag est effectué avec le module de quantification Volocity. Pour les ensembles de l&#39;image où le mouvement par rapport à une synapse pré-formé doit être calculé, un algorithme de suivi automatisé est employé qui suit le bouton synaptique à travers la séquence entière. L&#39;inspection manuelle des régions d&#39;intérêt défini par le logiciel Alignement automatique doit être effectuée pour confirmer que le logiciel a correctement suivi l&#39;objet désiré. Pour les objets, où le contraste avec les objets environnants est trop faible, le suivi manuel ne peut être effectuée sur une base trame par trame. Le progiciel permet Volocity l&#39;exportation de l&#39;emplacement XYZ, le volume et le signal intégré dans les objets désirés. La distance entre la synapse et la vitesse de l&#39;objet suivi sont calculées en normalisant les mouvements vers le centre du bouton synaptique. 8. Les résultats représentatifs Dans les 10 à 15 minutes de mélange ne doit être en mesure de visualiser le VIH Gag-iGFP cellules Jurkat exprimant adhérant aux cellules CD4 + primaires T. Imagerie ces conjugués, on peut évaluer les mouvements des points lacrymaux Gag dans les cellules infectées ainsi que dans les cellules cibles après synaspe. On peut observer le mouvement des Gag-iGFP lacrymaux dans les cellules cibles, peu après les synapses se forment.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

Nous décrivons ici une méthode simple pour visualiser le transfert du VIH de la cellule-cellule. Des recherches récentes de notre laboratoire et les autres »suggère que ce pourrait être le mode prédominant de la propagation du VIH entre les cellules T. La méthode décrite ici emploie une forme recombinante du VIH, appelé VIH Gag-iGFP, qui porte une étiquette codée génétiquement la protéine fluorescente verte dans le noyau protéique, Gag structurelles. En raison de niveaux élevés de GFP produite dans chaque particule virale, ce clone compétents pour la réplication du VIH permet aux chercheurs de suivre particules virales en temps réel. Ce virus devrait être particulièrement utile dans les études concernant le transfert d&#39;assemblage et de cellule à cellule du VIH. Le transfert du VIH d&#39;ici à cellules de transfert est très efficace. Pendant une heure trois co-culture, nous la routine voir le virus transféré à 20-30% des cellules T primaires évaluée par cytométrie en flux. Efficacités similaires sont qualitativement vu pendant imagerie des cellules vivantes. Infectées par des virus les cellules T commencent synapses formant avec infectés primaires cellules T presque immédiatement après l&#39;initiation de la co-culture. Intéressant, non pas toutes les écoles primaires des cellules T sont capables d&#39;interagir avec des cellules Jurkat infectées par le VIH, malgré les interactions forcées avec pinces optiques (observations non publiées, GM). VIH Gag-iGFP sera sans doute utile pour déterminer des sous-ensembles de cellules T qui sont plus sensibles à la cellule-cellule de transfert, à la fois in vitro et in vivo.

<table><tbody><tr><td>Cellules T Jurkat</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Couches de leucocytes provenant de sang total</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système Nucleofector et solution V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kits EndoFree Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide HIV Gag-iGFP</td><td>Chen Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit d'isolement des cellules T CD4+</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colorants Celltracker/CellTrace</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu indépendant de CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambres d'observation</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Olympus IX-71</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectif à immersion huile PlanApo N 1.42NA 60X</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser à gaz ionique ArKr Innova 70C</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unité confocale à disque rotatif de type Nipkow CSU-10</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Séparateur dichroïque Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande 525/50</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caméra à couplage de charge multipliée par électrons iXon+ 897</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chauffage thermostatique ASI 400</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation cellule à cellule de transfert du vih en utilisant des clones fluorescents du vih et live microscopie confocale

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

En fusionnant la protéine fluorescente verte à leurs protéines préférées, les biologistes ont maintenant la possibilité d&#39;étudier les processus cellulaires vivants complexes en utilisant la microscopie à fluorescence vidéo. Pour suivre les mouvements de la protéine virus d&#39;immunodéficience humaine noyau pendant de cellule à cellule de la transmission du virus de l&#39;immunodéficience humaine, nous avons GFP-taggés la protéine Gag dans le contexte d&#39;un clone moléculaire infectieux du VIH, appelé VIH Gag-iGFP. Nous étudions ce clone viral en utilisant la microscopie confocale vidéo. Dans l&#39;expérience suivante visualisées, nous transfecter une lignée cellulaire humaine T avec le VIH Gag-iGFP, et nous utilisons des CD4 non infectés marqués par fluorescence + cellules T pour servir de cellules cibles du virus. En utilisant les différentes étiquettes fluorescentes, nous pouvons facilement suivre la production virale et de transport à travers les structures intracellulaires appelées synapses virologiques. Simple perméables aux gaz chambres d&#39;imagerie nous permettent d&#39;observer des synapses avec la microscopie confocale en direct de minutes à plusieurs jours. Ces approches peuvent être utilisées pour suivre protéines virales comme ils se déplacent dans d&#39;une cellule à l&#39;autre.

Cette expérience visualisé est un guide pour utiliser un clone moléculaire fluorescent du VIH pour vivre des expériences d&#39;imagerie confocale.

Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

En fusionnant la protéine fluorescente verte à leurs protéines d'intérêt, les biologistes ont désormais la possibilité d'étudier des processus cellulaires complexes et vivants à l'aide de...

Cette procédure utilise l'imagerie de cellules vivantes pour visualiser le transfert du VIH marqué avec la GFP à travers les synapses virologiques entre les cellules T CAT exprimant le VIH et des cellules T primaires non infectées. Le test de transfert cellule à cellule commence par la transfection des cellules T CAT avec le VIH gag IG FP, un clone infectieux et fluorescent du VIH-1. Les cellules T CAT transfectées exprimant le VIH gag IG FP sont ensuite mélangées à des cellules T primaires non infectées marquées au C-M-T-M-R et chargées dans une chambre d'imagerie, où le transfert du VIH marqué avec la GFP à travers la synapse virologique peut être observé.Les données obtenues sont analysées à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images afin de révéler les détails du transfert du VIH à travers les synapses virologiques des cellules T. Bonjour, je m'appelle Benjamin Dale du laboratoire de Ben Chen, Département de médecine à la Mount Sinai School of Medicine. Je m'appelle Greg McNerney, chercheur dans le laboratoire du Dr Thomas Huser au Centre NSF pour la biophotonique au centre médical de l'uc Davis.Et je suis Deanna Thompson, également du laboratoire du Dr Thomas Huser. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de visualiser le transfert cellule à cellule du VIH-1 à l'aide de la microscopie confocale en temps réel. Dans cette procédure, les cellules Jurkat sont transfectées avec un clone moléculaire infectieux du VIH, uniquement par du personnel de laboratoire qualifié travaillant dans un laboratoire agréé en biosécurité.Des salles de culture de tissus de niveau deux plus ou de niveau de sécurité biologique trois peuvent réaliser le protocole décrit ici. Le travail avec le VIH infectieux dans les installations d'imagerie doit être approuvé par le bureau local de sécurité biologique de l'établissement. Maintenir les cellules jerk cat destinées à être utilisées comme cellules donneuses à une concentration comprise entre deux fois dix puissance cinq et huit fois dix puissance cinq cellules par millilitre.Dans la culture de cellules de jerk cat, une concentration cellulaire supérieure à huit fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre entraîne une réduction de l'efficacité de la transduction. Pour commencer la procédure, transfectez cinq fois 10 à la puissance six cellules de jerk cat avec le plasmide viral HIV gag IGFP en utilisant la méthode d'électroporation Amax Nucleofection telle que décrite dans le protocole écrit accompagnant, puis laissez les cellules se récupérer toute la nuit. Les cellules mononucléées du sang périphérique sont purifiées à partir de culots globulaires de sang humain total par centrifugation en gradient de densité au FICO.Les lymphocytes T CD4 positifs primaires sont purifiés à partir des cellules mononucléées du sang périphérique par sélection négative à l'aide d'un kit d'isolement des lymphocytes T CD4 positifs. Les lymphocytes T CD4 positifs sélectionnés négativement sont récupérés à partir d'une colonne magnétique et cultivés dans notre PMI contenant 10 % de FPS, supplémenté avec 10 unités par millilitre d'IL-2 humaine recombinante. On peut également aliquoter les lymphocytes T CD4 positifs primaires isolés et les congeler à l'aide de récipients cryogéniques. Les récipients de congélation sont placés dans un congélateur à moins 70 degrés Celsius pendant un minimum de trois à quatre heures.Les cellules sont ensuite transférées dans de l'azote liquide pour une conservation à long terme. Maintenant que les cellules jerk head ont été transfectées et que les cellules T primaires ciblées, positives pour le CD4, ont été isolées, passez au nettoyage et à l'étiquetage des cellules le jour suivant la transfection. Les cellules jerk expriment désormais le vecteur infectieux de VIH fluorescent.Lors de la manipulation d'échantillons infectieux, nous portons une blouse de laboratoire à fermeture frontale et deux paires de gants. Éliminer les débris cellulaires des cellules transfectées par centrifugation dans un milieu de densité élevée de fial high pack. Commencez par distribuer 1,5 millilitre de fial pack au fond d'un tube conique de 15 millilitres.Ensuite, recouvrez délicatement le matériau en gradient avec les cellules transfectées jerk hat dans un volume de cinq millilitres de notre milieu PMI. À ce stade, les cellules transfectées jerk hat sont capables de produire du VIH infectieux. Par conséquent, toutes les pointes de pipette ayant été en contact avec les cellules exprimant le VIH doivent être désinfectées à l’aide d’une solution d’eau de Javel à 10 %.Avant de jeter dans un récipient situé dans la cabine de sécurité biologique, boucher le tube et pulvériser l'extérieur du tube avec une solution d'éthanol à 70 %, puis essuyer avec un essuie-tout sec. Centrifuger les cellules à 400 G pendant 20 minutes à température ambiante avec le frein désactivé. Après la centrifugation, utiliser une pipette pour retirer soigneusement les cellules de l'interface avec le milieu et transférer les cellules dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Diluer les cellules avec notre milieu PMI jusqu'à un volume total de 15 millilitres et centrifuger à 300 G pendant 10 minutes.À température ambiante, nous suspendons le culot dans trois millilitres de milieu de culture jerk hat et transférons dans une cavité de deux centimètres d'une plaque à six puits. Placer la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire jusqu'au lendemain, moment où elle sera utilisée. Le soir même, étiqueter les lymphocytes T primaires CD4 positifs utilisés comme cellules cibles afin de les distinguer des cellules donneuses. Culer quatre fois 10 des six lymphocytes T primaires CD4 positifs en centrifugeant à 400 ×g pendant 10 minutes.Ensuite, lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS et resuspendez-les dans deux millilitres de PBS. Ajoutez le traceur cellulaire orange à une concentration finale de 1,5 micromolaire et incubez à 37 degrés Celsius pendant plusieurs minutes. Une fois l'incubation terminée, ajoutez huit millilitres de milieu Chica complet et centrifugez à 400 ×g pendant 10 minutes.Resuspendre les cellules dans trois millilitres de milieu complet supplémenté avec 10 unités par millilitre d'IL-2 et placer dans l'incubateur de culture tissulaire pendant la nuit. Après l'incubation nocturne, les cellules donneuses et les cellules cibles sont prêtes pour l'expérience de transfert cellule à cellule. Avant de mettre en place l'expérience de transfert cellule à cellule, préparer la chambre d'imagerie afin d'isoler la plateforme des fluctuations de température ambiante.Pour bloquer la lumière ambiante de la pièce, une grande housse noire est placée sur l'ensemble du dispositif de chauffage du microscope, créant une poche d'air isolée autour du système. La chambre d'observation est maintenue à une température stable de 37 degrés Celsius à l'aide d'un chauffage thermostaté équipé d'une sonde thermocouple de type T positionnée à côté de l'échantillon pour un contrôle en boucle fermée de la température. Préchauffer pendant 30 minutes avant de monter l'échantillon.L'imagerie confocale à disque tournant avec un microscope optique inversé est utilisée pour créer des images confocales 3D du transfert de cellule à cellule du VIH. Tous les composants matériels et l'acquisition, y compris une platine Z, sont contrôlés par le logiciel MetaMorph ou MetaMorph IQ version 1.8. La numérisation est effectuée par une unité confocale à disque tournant CSU-10 qui utilise simultanément plus de 800 points confocaux, augmentant ainsi considérablement la vitesse de balayage afin de tirer parti de sa rapidité. Le CSU-10 est couplé à une caméra CCD à multiplication électronique très sensible, permettant une imagerie rapide en faible luminosité, ce qui réduit à la fois le photoblanchiment et la phototoxicité.La source de lumière fluorescente est un laser à gaz ionique argon-krypton à multiples longueurs d'onde. Un filtre optique accordable And or Oko ou A OTF est utilisé pour sélectionner les longueurs d'onde souhaitées, ici 488 nanomètres et 568 nanomètres, tout en contrôlant leur puissance afin de réduire davantage le photoblanchiment et d'allonger la durée d'acquisition d'images. L'A OTF obture rapidement le laser après chaque exposition de 15 à 30 millisecondes, lorsque la caméra n'acquiert pas d'images, évitant ainsi une exposition inutile pendant le transfert des images de la caméra E-M-C-C-D vers l'ordinateur.La lumière laser est intégrée au système de disque tournant à l’aide d’un miroir dichroïque quadruple bande 405 488 568 647. L’émission fluorescente est séparée par longueur d’onde à l’aide d’un miroir dichroïque longue passe de 560 nanomètres équipé d’un séparateur d’image. Le canal vert est filtré à l’aide d’un filtre passe-bande de 525/50 nanomètres et le canal rouge est filtré à l’aide d’un filtre passe-bande de 609/54 nanomètres. Les deux canaux sont projetés côte à côte sur la caméra E-M-CCD.Pendant que la chambre d'imagerie atteint sa température de fonctionnement, préparez les cellules pour l'expérience de transfert de cellule à cellule. Utilisez un cytomètre hématique pour dénombrer les cellules exprimant HIV gag IGFP. Placez le cytomètre hématique dans une boîte de Pétri afin d'éviter toute exposition directe aux cellules exprimant le virus.Lavez les cellules avec un milieu indépendant du dioxyde de carbone et resuspendez-les dans un milieu d'imagerie de cellules vivantes à une concentration de un à trois fois 10⁷ cellules par millilitre. L'utilisation d'un milieu indépendant du dioxyde de carbone élimine la nécessité d'une chambre environnementale au dioxyde de carbone. Pour l'imagerie.Les cellules comptent également, lavent et resuspendent les lymphocytes T primaires marqués CD4 positifs comme vient de l'être montré pour les cellules Dur hat. Ensuite, initier le transfert cellule à cellule en mélangeant 20 microlitres de cellules Dur hat transfectées par HIV gag IGFP avec 40 microlitres de lymphocytes T primaires marqués CD4 positifs, puis charger 50 microlitres dans une chambre microscopique EBD traitée pour la culture tissulaire et perméable aux gaz. Sceller la chambre avec des bouchons et fixer les bouchons en enveloppant l'interface chambre-bouchon EBIT D avec du paraform.Essuyez la chambre d'imagerie avec un chiffon chimique imprégné d'éthanol à 70 % et laissez-la sécher brièvement à l'air dans la hotte. Transportez la chambre d'imagerie scellée dans un récipient fermé afin d'éviter toute exposition accidentelle. Si la chambre venait à tomber pendant le transport juste après le chargement de la chambre d'imagerie IBD avec des cellules, fixez l'appareil sur le microscope.Prenez des images de paires de cellules à l’aide d’un objectif à immersion huile de 60 x 1,42 NA, car une ouverture numérique élevée améliore considérablement la résolution et permet de maximiser la vitesse d’acquisition des piles d’images 3D. Réduisez la zone d’enregistrement de la caméra du CD EM à la région immédiate d’une paire de cellules. En outre, un grand pas en Z compris entre 0,45 et 0,75 micromètre peut également accélérer l’acquisition dans ces conditions.Des images sont enregistrées en continu à des intervalles de 20 à 60 minutes. L'imagerie répétée du même emplacement de l'échantillon peut s'étendre jusqu'à six heures avec un photoblanchiment minimal lorsqu'elle est effectuée. Chaque segment de données comprend des dizaines de milliers d'images pouvant occuper un volume total de cinq à 20 gigaoctets.Pour faciliter le transport et l'analyse des fichiers volumineux, chaque fichier est divisé et exporté sous forme de segments d'image TIFF d'un gigaoctet. Pour analyser les images acquises, utilisez l'un des nombreux logiciels d'analyse d'images. Reportez-vous au protocole écrit joint pour obtenir les détails relatifs à l'analyse des images, y compris la correction de l'élimination de l'intensité et le suivi automatique et manuel des points gag.Entre 10 et 15 minutes après le mélange, on peut observer des cellules de chat exprimant HIV gag IGFP adhérant à des cellules T primaires CD4 positives en imagerie. Ces conjugués permettent d'évaluer les mouvements des points gag dans les cellules infectées ainsi que dans les cellules cibles. Après la synapse, entre 30 minutes et trois heures, on peut observer un déplacement des points gag IGFP vers les cellules cibles marquées au traceur cellulaire.Nous venons de vous montrer comment visualiser le transfert de cellule à cellule du VIH entre les lymphocytes T. Lorsque vous effectuez ces procédures, il est très important de respecter scrupuleusement toutes les précautions de niveau de biosécurité 2+ ou de niveau de biosécurité 3 lors de la manipulation d'échantillons ayant été exposés à des cellules exprimant le VIH. N'oubliez pas également d'utiliser des cellules JCA bien entretenues et de l'ADN sans endotoxines afin d'optimiser la transfection.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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