Name: Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Apprenez à générer des vers transgéniques chez C. elegans par bombardement biolistique avec des particules d'or recouvertes d'ADN. Cette méthode efficace permet d'étudier la régulation des gènes par les facteurs de transcription.

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Ce travail a été soutenu par des fonds d&#39;amorçage de l&#39;Université de Pittsburgh et aux NIH AG028977 ALF

Aperçu Traditionnellement les vers transgéniques ont été générées par micro-injection d&#39;ADN transgénique dans le C. elegans germinale 1,2,3,4. Bien réussie, cette approche nécessitait des équipements spécialisés et le développement de l&#39;expérience avec l&#39;anatomie ver et la technique de micro-injection. Plus récemment bombardement biolistique a été développé comme une autre approche qui utilise des particules d&#39;or enrobées d&#39;ADN pour introduire un ADN étranger dans le 5,6 germinale. Cette approche exige un investissement de moins de temps en termes de pratique pour réussir. Le bombardement biolistique de C. elegans pour générer des vers transgéniques a une faible efficacité au niveau du ver individuels afin de succès nécessite une grande quantité d&#39;animaux. Ceux-ci peuvent être cultivées de diverses façons, mais nous utilisons des plaques d&#39;oeuf afin de réduire le travail et le nombre de plaques impliquées. Notre protocole commence avec la préparation des plaques d&#39;œufs et les vers, puis se concentre sur le protocole de bombardement à l&#39;aide de la Bio-Rad PDS-1000/He Hepta système. Nous avons adapté notre protocole en partie de travaux de Berezikov et al 7. Avec les bombardements, le gène unc-119 est généralement utilisé comme marqueur pour les animaux transgéniques. Worm souches portant cette mutation sont sévèrement coordination et à peine bouger, sont plutôt moche en apparence, et sont incapables de former des larves dauer 8. Le dauer est une étape de remplacement des larves qui est utilisée pour retarder le développement d&#39;un adulte reproducteur dans des conditions défavorables, et l&#39;entrée en dauer est réglementée par de multiples gènes 9. Plusieurs souches porteuses du gène unc-119 sont disponibles à partir du C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). L&#39;original DP38 souche (UNC-119 (ED3)) effectue également une formation sans lien avec Dauer-constitutifs (daf-c) mutation qui pourrait affecter les expériences en aval. Plusieurs laboratoires ont outcrossed cette mutation, et la souche HT1593 est disponible à partir de la CCG. Nous trouvons que les animaux transgéniques sont un peu plus facile à identifier avec la souche DP38 et ont tendance à utiliser cette souche pour la création d&#39;animaux transgéniques. Lorsque nécessaire, nous utilisons HT1593 au croisement des vers transgéniques pour enlever la mutation daf-c. Obtenir le DP38 les vers de se développer est l&#39;une des plus lentes étapes dans le protocole afin que nous conserver un stock de plaques de croissance tout en préparant les transgènes. L&#39;expression du marqueur unc-119 avec le gène d&#39;intérêt permet d&#39;identifier facilement les animaux exprimant le transgène basée sur le sauvetage de la motilité normale et 5 la taille du corps. L&#39;UNC-119 du gène peut être obtenu à partir de plusieurs sources, et les vecteurs en utilisant l&#39;ADN génomique unc-119, unc-119 promoteur et d&#39;ADNc, et l&#39;ADN génomique pour les petits C. briggsiae gènes sont utilisés 8,10. Nous avons récemment décrit un protocole simple d&#39;ajouter une cassette unc-119 à un plasmide contenant un gène de résistance à l&#39;ampicilline par recombinaison homologue 11 et une méthode pour modifier fosmides ver pour porter le gène unc-119 par recombinaison Cre-lox pour générer des animaux transgéniques 12. Les plasmides sont disponibles à partir Addgene Inc (Cambridge, MA). Alors que les efforts impliqués dans l&#39;exécution d&#39;un bombardement unique est significatif mais gérable, le travail supplémentaire à effectuer des bombardements multiples sur une seule journée est minime. Par conséquent, nous avons l&#39;habitude pôle de la production des vers transgéniques pour diminuer le travail nécessaire pour générer chacun. 1. La préparation des plaques d&#39;oeufs Les vers unc-119 mutantes sont difficiles à croître sur des plaques NGM standard, car grâce à leur mobilité réduite, ils ont tendance à mourir de faim sur les pièces d&#39;une plaque en d&#39;autres parties de la plaque encore contenir des aliments. Plaques d&#39;œufs résoudre ce problème que la couche épaisse des aliments sur des plaques d&#39;oeuf permet unc-119 vers de terre pour ramper plus facilement et à prendre sur toute la plaque 7. Les plaques d&#39;œufs ont également l&#39;avantage de soutenir la croissance d&#39;un grand nombre de vers afin que moins de plaques sont nécessaires 13. Habituellement 5 plaques d&#39;œufs sont suffisantes pour pousser les vers pour un bombardement. La recette ci-dessous fait environ 50 plaques, mais peuvent être réduits de moitié à faire moins, si désiré. Les plaques d&#39;oeuf peut devenir facilement contaminés afin que nous utilisons à la fois les antibiotiques et les antifongiques dans les plaques et de n&#39;utiliser que des œufs produits par traitement à l&#39;hypochlorite pour l&#39;ensemencement des plaques. Jour 1: <ol><li> Préparer LB (400 ml) dans une bouteille de 500 ml. Autoclave pendant 20 minutes. </li><li> Verser environ 50 plaques de 10 cm en utilisant une NGA NGA litres avec 2% d&#39;agar. Nous ajoutons nystatine 10 ml par litre et la streptomycine à 200 pg / mL 13. </li><li> Cultiver une culture de 40 ml de nuit de OP50-1 dans LB avec 200 ug / ml de streptomycine. Cette souche est résistante la streptomycine et disponible auprès de la CCG. </li><li> Autoclave une bouteille de 500 ml pourlendemain. </li></ol> Jour 2: <ol><li> Séparez les jaunes d&#39;œufs de poule 10 dans le flacon stérile. Nous utilisons un séparateur jaune (disponible dans les magasins des ménages, y compris la cible). Shake. </li><li> Amener le volume à 400 ml avec LB. Secouer </li><li> Incuber à 60 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Ajouter 40 ml d&#39;OP50-1. Secouer </li><li> Distribuer 5-8 ml de mélange par plaque. </li><li> Laisser les plaques à régler à la température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li></ol> Jour 3: <ol><li> Verser délicatement le liquide restant hors de plaques. Laisser sécher avec des couvercles sur les à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li></ol> Jour 4: <ol><li> Mettez les plaques dans une boîte ou un sac en plastique et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Ces plaques semblent être OK pour utiliser pendant 1-2 mois. </li></ol> 2. Semis Plaques Egg <ol><li> Développez le DP38 vers sur 6 assiettes NGA cm en ajoutant OP50 concentrée sur des plaques récemment affamés. Pour un bombardement simple, nous utilisons ~ 6 petites assiettes à des plaques de semences oeuf 5. Pour de multiples bombardements, nous utilisons les petites plaques de semences au lieu plaques 2 enrichi peptonée avant d&#39;ensemencer les plaques d&#39;oeufs. </li><li> Isoler les œufs des vers DP38 via l&#39;utilisation d&#39;hypochlorite de 13,14. Resuspendre les oeufs dans stériles tampons S-basale ou M9 13,14. </li><li> Ajouter les oeufs (&gt; 10 000 par plaque) pour le nombre approprié de plaques d&#39;oeuf. Cultivez les vers sur des plaques d&#39;oeuf à 20 ° C pendant 7-10 jours pour l&#39;utilisation d&#39;un bombardement. Les plaques seront prêts à utiliser une fois que les vers ont commencé à effacer la nourriture de l&#39;assiette. Ces plaques sont vraiment difficiles à affamer et croissante pour des durées plus longues seront d&#39;améliorer le rendement ver. </li></ol> Bombardement Nous préparons le stock d&#39;or à l&#39;avance et le garder conservés à 4 ° C pour les utiliser. Il faut également des souillures et tachetée 10 cm plaques NGA. Les plaques doivent être sans tache versé à l&#39;avance et a permis de sécher complètement pour faciliter l&#39;absorption du liquide ajouté avec les vers. Le jour du bombardement, nous laver les vers d&#39;abord, puis commencer à préparer l&#39;ADN des particules revêtues d&#39;or. Nous ajoutons ensuite les vers sur les plaques sans tache NGA et terminer le lavage des particules d&#39;or et de les transférer au macrocarriers. Préparation de particules d&#39;or: <ol><li> Peser 60 mg de particules d&#39;or dans un tube 1.7mL et laisser tremper dans de l&#39;éthanol 70% pendant 15 min. Centrifuger brièvement pour précipiter les particules d&#39;or. </li><li> Lavez 3 fois dans de l&#39;eau stérile et centrifuger brièvement à chaque fois pour collecter de l&#39;or. </li><li> Resuspendre l&#39;or dans 1 ml de glycérol stérile à 50%. C&#39;est la solution stock d&#39;or et de particules peuvent être stockés pendant des mois à 4 ° C. </li></ol> Worms: <ol><li> Faites flotter le DP38 vers les plaques en oeuf avec le tampon S-basale ou M9 et les transférer à un tube de 50 ml conique. </li><li> Conserver les tubes sur le banc jusqu&#39;à ce que les vers sont dans le fond. Puis aspirez le tampon et ajouter des nouvelles S-basale ou M9. Lavez 2 ou 3 fois, jusqu&#39;à ce tampon est relativement claire de débris. Gardez les vers à cette étape jusqu&#39;à ce que le revêtement ADN est terminée. </li><li> Aspirer et laisser environ 2-3 ml de tampon par des vers dans un bombardement. Transfert à une plaque de 10 cm NGA souillures sur la glace. Il est important de minimiser le volume transféré comme la plaque NGA auront besoin de sécher complètement avant de bombardement. Soyez sûr de couvrir toute la surface de la plaque avec les vers. </li><li> Laisser sécher la plaque sur la glace. La glace empêcher les vers de grumeaux pendant le séchage. </li></ol> Cette étape est importante: la plaque doit être sec et les vers dispersé uniformément sur la plaque de NGA. Garder les vers sur la glace les empêche de se déplacer sur la plaque et l&#39;agrégation en tas. Préparation d&#39;ADN (pour un bombardement): <ol><li> Mélanger dans un tube 1.7mL: <ul><li> 50 pl des particules d&#39;or. Resuspendre soigneusement avant d&#39;ajouter. </li><li> 50 pl d&#39;ADN (10-15ug). Nous voyons peu de différence entre l&#39;ADN circulaire ou linéaire. Habituellement, nous utilisons Qiagen cartouches Midiprep pour la purification d&#39;ADN (Qiagen Inc, Valencia, CA). </li><li> 50 pl 2,5 M CaCl 2. Cette solution est stable pendant plusieurs semaines à température ambiante. </li><li> 20 pi 0,1 M spermidine. La spermidine est instable en solution aqueuse. Nous faisons aliquotes spermidine 70μl et conserver à -20 ° C. Nous ajoutons ensuite 1 ml d&#39;eau juste avant l&#39;utilisation pour obtenir une solution 0.1M. Cette solution doit être préparée fraîche pour chaque bombardement. En général, nous vortex les particules d&#39;or dans un tube 1.7mL à basse vitesse et ajoutez le CaCl 2, de l&#39;ADN et la spermidine / goutte à goutte tout en protamine vortex. Pour les gens qui ont transfectées avec du phosphate de calcium de cette technique est familière. Nous avons également utilisé la protamine lieu de spermidine avec de très bons résultats 15. Nous préparons une nouvelle solution (1mg/ml) dans de l&#39;eau et nouse 50 pl au lieu de la 20 pi de spermidine. Si nous utilisons la protamine, nous avons l&#39;habitude incuber le mélange à la température ambiante pendant 10 minutes au lieu de placer sur la glace. Protamine n&#39;a pas besoin d&#39;être conservés congelés et est une poudre au lieu d&#39;un liquide. </li></ul></li><li> Incuber le mélange sur la glace pendant 30 minutes, mélangez et périodiquement pour maintenir les particules d&#39;or en suspension. Puis centrifuger brièvement et aspirer le surnageant. </li><li> Laver avec de l&#39;éthanol 300μl de 70%. Spin brièvement. </li><li> Laver avec de l&#39;éthanol à 100% 1ml. Spin brièvement. </li><li> Remettre en suspension dans 170μl d&#39;éthanol 100%. </li></ol> Préparation de macrocarriers: <ol><li> Rincez 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) dans le 2-propanol. Mettez-les sur du papier absorbant et les laisser sécher à température ambiante. </li><li> Ajouter 20 pi de l&#39;ADN / or mélange au centre de chaque macrosupport. Soyez sûr à droite avant le vortex de pipetage pour garder l&#39;or en suspension. </li><li> Laissez l&#39;éthanol s&#39;évapore. </li></ol> 3. Bombardement Veillez à effectuer un bombardement vierge avant l&#39;expérience de rincer l&#39;hélium dans le système. <ol><li> Mettez la pompe à vide et fermer piège pompe à vide. Nous utilisons une pompe à vide sans huile. </li><li> Allumez le réservoir d&#39;hélium. Vérifier que la pression est ≥ 2200psi. </li><li> Disque de rupture Wet (1350 psi) dans le 2-propanol, la mise en conservant plafond pour hepta adaptateur. </li><li> Vis adaptateur dans PDS-1000 du système et serrez avec la clé dynamométrique fournie. </li><li> Placez le 7 macrocarriers dans le support et le siège avec l&#39;outil fourni. Puis mettre un écran d&#39;arrêt hepta et le fond sur le support. Retournez le support et placez sur la deuxième étagère du haut. Le côté or repéré de l&#39;macrocarriers doit être orientée vers le bas à ce point. </li><li> Alignez les trous dans le haut du porte-macrosupport avec les prises de l&#39;adaptateur hepta. </li><li> Placer la plaque recouverte d&#39;NGA vers (hors couvercle) sur l&#39;étagère du bas dans la chambre de bombardement. </li><li> Totalement ouvert le vide débit bouton sur le PDS-1000. Appuyez sur le bouton jusqu&#39;à ce vac chambre atteint 26 En Hg. Puis passez à tenir la position pour maintenir le vide. </li><li> Appuyez et maintenez le bouton de tir jusqu&#39;à ce ruptures disque. Cela se produira lorsque la pression atteint 1350psi. Parfois, cela prend 50 à 20 secondes pour se produire. Relâchez le bouton. </li><li> Communiqué de vide de la chambre (position d&#39;évent), et retirez la plaque. </li><li> Tourner à vide et hors d&#39;hélium. </li><li> Incendie à plusieurs reprises jusqu&#39;à la ligne ne contient pas d&#39;hélium (jauge d&#39;hélium doit marquer 0 psi). </li><li> Éteignez le système PDS-1000. </li></ol> La récupération après le bombardement Worm: <ol><li> Laisser la plaque bombardés à 20 ° C pendant 20 minutes. </li><li> Float les vers de la plaque avec 10 ml de tampon S-basale ou M9. </li><li> Mettez les vers 0.5mL le 20 - 10 cm repéré plaques NGA. </li><li> Laisser à 20 ° C de température ou la salle (22-24 ° C) pendant environ 2 semaines avant de vérifier les vers secourus. </li><li> Ecran pour les vers avec le phénotype unc-119 (+) avec un microscope à dissection. Le moment optimal pour le dépistage est, après les plaques ont faim, depuis les vers ont sauvé avantage de survie par rapport aux non-secourues vers. </li><li> Générer une ligne individuelle de chaque plaque de 10 cm qui contenaient des vers secourus. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le succès du protocole en ce qui concerne l&#39;obtention d&#39;animaux transgéniques dépend du transgène particulier. Pour le promoteur: transgènes rapporteur GFP, nous avons obtenu jusqu&#39;à 20 lignes. Un résultat plus typique est de 30 à 10 lignes. Jusqu&#39;à 30% des lignées transgéniques sont des lignes intégrées, mais cela est aléatoire et nous allons effectuer des bombardements multiples sur une seule journée, si une ligne intégrée est particulièrement souhaitée.

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</ol>

Bombardement biolistique est une méthode simple pour introduire un ADN étranger dans de nombreux organismes, y compris C. elegans 1,5,6,7,16. Elle repose sur des particules d&#39;or formant un complexe avec l&#39;ADN en présence de CaCl 2. Polyamines cationiques, tels que la spermidine, de protéger l&#39;ADN de la dégradation de la nucléase in vivo. Depuis la spermidine est une molécule instable, il est important de le stocker dans de petites aliquotes à -20 ° C, et de faire la bonne solut...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>Particules d'or</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1micron</td></tr><tr><td>Kits de midi-préparation</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>Protamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Macroporteurs</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Système PDS-1000/He Hepta</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Disque de rupture</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>Nystatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine </td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de souris transgéniques c. elegans par transformation biolistique

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Le nombre de laboratoires utilisant le C nématodes vivant libre elegans est en croissance rapide. La popularité de ce modèle biologique est attribué à un temps de génération rapide et courte durée de vie, entretien facile et peu coûteux, génome entièrement séquencé, et le tableau des ressources et des animaux mutants ARNi. De plus, l&#39;analyse de la C. elegans du génome a révélé une grande similitude entre les vers et les vertébrés supérieurs, ce qui suggère que la recherche dans les vers pourrait être un complément important aux études effectuées chez la souris tout ou cellules cultivées. Une partie puissant et important de la recherche ver est la possibilité d&#39;utiliser des animaux transgéniques pour étudier la localisation des gènes et leur fonction. Les animaux transgéniques peuvent être créées soit par micro-injection de la lignée germinale ver ou par l&#39;utilisation de bombardement biolistique. Bombardement est une technique plus récente et est moins familier à un certain nombre de laboratoires. Nous décrivons ici un protocole simple de générer des vers transgéniques par bombardement biolistique avec des particules d&#39;or en utilisant le Bio-Rad PDS-1000 du système. Par rapport à la microinjection d&#39;ADN dans les cellules germinales hermaphrodites, ce protocole a l&#39;avantage de ne pas nécessiter de compétences particulières de l&#39;opérateur en ce qui concerne l&#39;identification d&#39;anatomie ver ou d&#39;effectuer la microinjection. En outre plusieurs lignées transgéniques sont généralement obtenus à partir d&#39;un bombardement unique. Aussi, contrairement à la micro-injection, bombardement biolistique produit des animaux transgéniques avec les deux tableaux extrachromosomique et des transgènes intégrés. La capacité d&#39;obtenir des lignées transgéniques intégrés permet d&#39;éviter l&#39;utilisation de protocoles mutagène d&#39;intégrer l&#39;ADN étranger. En conclusion, le bombardement biolistique peut être une méthode intéressante pour la production d&#39;animaux transgéniques, en particulier pour les enquêteurs ne s&#39;intéressent pas à investir le temps et les efforts nécessaires pour devenir habile à la microinjection.

Des vers transgéniques sont couramment utilisés dans<em&gt; C. elegans</em&gt; Recherche. Décrite est un protocole simple, mais efficace, d&#39;introduire des transgènes dans les vers utilisant bombardement biolistique avec des particules d&#39;or enrobées d&#39;ADN. L&#39;effort et les résultats des bombardements se comparent favorablement avec microinjection pour la génération d&#39;animaux transgéniques.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

Le nombre de laboratoires utilisant le nématode de vie libre C. elegans augmente rapidement. La popularité de ce modèle biologique est attribuée à un cycle...

L'objectif général de cette procédure est de générer des vers transgéniques par transfection biotique ou au canon à gènes. Tout d'abord, de grandes quantités de vers sont cultivées, puis des particules d'or sont recouvertes d'ADN, et les vers sont bombardés. Les descendants transgéniques sont ensuite isolés et récupérés, et de nouvelles lignées transgéniques sont établies. Bonjour, je suis Daniel Owa du laboratoire du Dr Alfred Fisher du département de médecine de l'Université de Pittsburgh.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de générer des vers transgéniques. Nous utilisons cette procédure pour étudier la régulation des gènes par des facteurs de transcription. Commençons donc.La préparation des boîtes à œufs commence par la verse d'une mixture contenant 2 % d'agar dans un milieu NGA supplémenté en nystatine et en streptomycine. Dans des boîtes de 10 à 50 centimètres, laissez sécher les boîtes à température ambiante. Ensuite, stérilisez à l'autoclave 400 millilitres de milieu LB dans une bouteille de 500 millilitres et 40 millilitres de milieu LB dans un flacon de 250 millilitres.Autoclaver également une bouteille vide de 500 millilitres pendant 20 minutes. Une fois l'autoclavage terminé, ajouter de la streptomycine au milieu LB de 40 millilitres pour obtenir une concentration finale de 200 microgrammes par millilitre. Puis ensemencer avec la souche d’e coli.OP 50 tiret un. Laisser la culture croître toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, placer les jaunes de 10 œufs de poule dans la bouteille stérile de 500 millilitres.Compléter le volume à 400 millilitres avec du milieu LB et agiter pour obtenir une solution homogène. Incuber la solution à 60 degrés Celsius pendant une heure. Une fois que le mélange yo lb a refroidi à température ambiante, ajouter les 40 millilitres de culture ELI dans le flacon et agiter.Ensuite, pipetez cinq à huit millilitres de la culture sur les boîtes de NGA préparées. Laissez sécher toute la nuit à température ambiante le jour suivant. Versez tout liquide restant et faites sécher une nuit supplémentaire à température ambiante.À ce stade, les boîtes peuvent être conservées à quatre degrés Celsius pendant un à deux mois ou immédiatement ensemencées avec des vers. Pour amplifier une population de DP 38, ajouter une suspension concentrée d’E. coli OP50 sur des boîtes NGA de six centimètres contenant des vers DP 38 récemment privés de nourriture, puis incuber. Utiliser une solution alcaline d’hypochlorite pour isoler les œufs des vers DP 38.La procédure est décrite dans le protocole accompagnant. Une fois les œufs isolés, resuspendez-les dans du tampon S basique ou M9. Ajoutez plus de 10 000 œufs à chaque boîte de 10 centimètres préparée et laissez les vers se développer à 20 degrés Celsius pendant sept à dix jours.Une fois que les vers ont commencé à débarrasser la nourriture, les boîtes sont prêtes à être bombardées. Pour recouvrir les particules d'or d'ADN destiné au bombardement, ajoutez 60 milligrammes de particules d'or dans un tube de 1,7 millilitre. Ajoutez ensuite de l'éthanol à 70 % et laissez les particules d'or tremper pendant 15 minutes.Faites tourner brièvement le tube afin de former un culot avec les particules d'or. Versez délicatement l'éthanol. Lavez ensuite les particules d'or trois fois dans de l'eau stérile.Resuspendre l'or dans un millilitre de glycérol stérile à 50 %. La solution mère de particules d'or peut être conservée pendant plusieurs mois à quatre degrés Celsius. Ensuite, recueillir les vers en les faisant flotter à partir des boîtes à œufs à l'aide de tampons s basil ou M line.Ensuite, transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres. Laissez les vers se déposer au fond du tube. Puis aspirez tout le tampon sauf deux à trois millilitres en utilisant le tampon restant.Transférez les vers sur une plaque NGA de 10 centimètres non ensemencée, préalablement refroidie sur de la glace. Répartissez les vers sur toute la surface de la plaque. Laissez ensuite la plaque sécher complètement sur la glace.Cela empêchera les vers de s'agglomérer pendant le processus de séchage. Il est important que les vers soient répartis uniformément et que la boîte soit complètement sèche avant la procédure de bombardement. Pour préparer les particules d'or revêtues d'ADN, ajoutez 50 microlitres de particules d'or remises en suspension dans un tube de 1,7 millilitre.Faire centrifuger les particules d'or et éliminer le surnageant. Ensuite, ajouter un mélange de 10 à 15 microgrammes d'ADN purifié, circulaire ou linéarisé, d'intérêt et de 20 microlitres de spermine 0,1 molaire fraîchement préparée. Enfin, tout en vortexant doucement le tube, ajouter 50 microlitres de chlorure de calcium 2,5 molaire et incuber le mélange sur de la glace pendant 30 minutes avec des brassages périodiques afin de maintenir les particules d'or en suspension.Après 30 minutes, centrifuger une courte durée le mélange de particules d'or. Aspirer brièvement le surnageant et laver avec 300 microlitres d'éthanol à 70 %, puis avec un millilitre d'éthanol à 100 %. Finalement, resuspendre les particules d'or recouvertes d'ADN dans 170 microlitres d'éthanol à 100 %. Pour chaque bombardement, rincer sept porte-objets macroscopiques destinés à contenir les particules d'or dans deux propanols, puis les laisser sécher à température ambiante.Vortexez une solution d'ADN et d'or. Ensuite, pipetez 20 microlitres au centre de chaque support macro. Laissez l'éthanol s'évaporer.Insérez le disque de rupture dans l'adaptateur Hector et fixez fermement l'adaptateur dans l'appareil de bombardement. Ensuite, placez les sept macro-porteurs dans le support et utilisez l'outil fourni pour les positionner correctement. Placez ensuite un écran d'arrêt Hector et le fond sur le support.Retournez le support afin que le côté du macroporteur avec les points dorés soit orienté vers le bas. Placez-le sur la deuxième étagère en partant du haut. Alignez les trous situés en haut du support de macroporteur avec les sorties de l'adaptateur Hector.Retirez le couvercle de la boîte de NGA revêtue de vers et placez-le sur l'étagère la plus basse de la chambre de bombardement. Ouvrez complètement le bouton de débit du vide et appuyez sur le bouton vac, en le maintenant enfoncé, jusqu'à ce que la chambre atteigne 26 pouces de mercure. Passez ensuite en position hold pour maintenir le vide, puis appuyez et maintenez enfoncé le bouton fire jusqu'à ce que le disque se rompe.Cela se produira lorsque la pression atteindra 1 350 PSI et peut prendre de cinq à vingt secondes. Relâchez le bouton, relâchez le vide de la chambre en passant à la position de décharge et retirez la plaque. Éteignez le vide dans l'hélium.Ensuite, appuyez plusieurs fois sur la gâchette jusqu'à ce que la ligne d'hélium soit claire et que le manomètre d'hélium indique zéro PSI. Éteignez enfin le système PDS 1000. Maintenant que les vers ont été transformés, ils peuvent être récupérés et incubés après le bombardement.Placer la boîte à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, faire flotter les vers à partir de la boîte avec 10 millilitres de tampon S basil ou M nine, puis ensemencer des boîtes NGA de 2010 centimètres avec 0,5 millilitre des vers dans le tampon. Laisser ensuite les boîtes à température ambiante pendant environ deux semaines.Rechercher une récupération du phénotype UNC one 19 par le transgène et générer une lignée individuelle à partir de chaque boîte de 10 centimètres contenant les vers récupérés. La réussite du protocole concernant l'obtention d'animaux transgéniques dépend du transgène particulier. Pour les transgènes rapporteurs avec promoteur GFP, nous avons obtenu jusqu'à 20 lignées.Un résultat plus typique comprend trois à dix lignées. Jusqu'à 30 % des lignées transgéniques sont des lignées intégrées, mais cela est aléatoire et nous effectuerons plusieurs bombardements en une seule journée si une lignée intégrée est particulièrement souhaitée. On observe ici une plaque représentative de 10 centimètres montrant un mutant 19 vers secouru par bombardement transgénique.Les vers sauvés peuvent être identifiés par leur taille plus grande et leur mobilité nettement améliorée par rapport aux vers non transformés. Sur un total de 19 mutants. L'isolement des vers sauvés transformés avec un transgène GFP éloigné entraîne une expression de la GFP.Ce transgène exprime fortement la GFP dans l'intestin et l'hypoderme des vers transgéniques. Ce transgène particulier est intégré dans le chromosome du ver, et 100 % de la descendance exprime le transgène. Nous venons de vous montrer comment réaliser un bombardement biolistique de Sea Elegans lors de l'exécution de cette procédure.Il est important de faire pousser suffisamment de vers et d'utiliser un milieu frais. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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