Silençage génique basé sur la transfection inverse siRNA in vitro : une procédure pour délivrer de petits ARN interférents dans des cellules cultivées afin d’inactiver l’expression du gène cible

Pour la transfection inverse de petits ARN interférents, ou siRNA, une classe d’ARN double brin, dans des adipocytes ou des cellules adipeuses non adhérents, préparez une suspension de siRNA ciblant un gène codant pour une protéine spécifique dans les adipocytes. Ajouter un réactif de transfection à base de lipides cationiques approprié. Incuber le mélange pour former des complexes de transfection par interactions électrostatiques.

Transférez le mélange dans les puits enrobés de collagène d’une plaque multi-puits. Les complexes de transfection s’immobilisent sur le revêtement de la plaque par des interactions non spécifiques. Pipeter une suspension d’adipocytes dans des puits contenant des complexes de transfection immobilisés. Les adipocytes adhèrent lâchement à l’enrobage de la plaque, augmentant le contact physique entre les cellules et les complexes.

Le complexe de transfection fusionne avec la membrane cellulaire et délivre l’ARNi dans le cytoplasme. Le siRNA, composé d’un brin antisens avec une séquence complémentaire à l’ARNm cible et d’un brin sens, est reconnu par le complexe de silençage multiprotéique induisant l’ARN, ou RISC. L’ARNi se lie au RISC et les brins se séparent, le brin antisens restant lié au complexe.

Le complexe siRNA-RISC activé reconnaît et se lie aux sites complémentaires de l’ARNm cible. Cela conduit à un clivage spécifique de la séquence de l’ARNm par la protéine argonaute du complexe RISC. L’ARNm clivé est davantage dégradé par la machinerie cellulaire, réduisant ainsi au silence l’expression des gènes cibles.