Silençage génique basé sur la transfection inverse siRNA in vitro : une procédure pour délivrer de petits ARN interférents dans des cellules cultivées afin d’inactiver l’expression du gène cible

Pipeter l’ARNi avec le milieu essentiel minimum amélioré à mélanger et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNsi, et pipeter pour mélanger. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez le mélange de transfection dans chaque puits de la plaque recouverte de collagène.

Lavez deux fois les cellules de la boîte de Pétri de 100 millimètres avec du DPBS. Ajoutez de la trypsine 5X aux cellules, en vous assurant de couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 secondes et retirez soigneusement la trypsine. Incuber la boîte de Pétri pendant 5 à 10 minutes à 37 °C dans l’incubateur.

Ensuite, tapotez la parabole pour détacher les cellules, évitant ainsi d’endommager les cellules. Ajoutez 10 millilitres de DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine, pour neutraliser la trypsine. Pipetez soigneusement le milieu de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire.

Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur de cellules automatisé, et ajustez la concentration des cellules à 6,25 x 10⁵ cellules/mL de milieu. Semez 800 microlitres de suspension cellulaire par puits d’une plaque de 12 puits, ou 400 microlitres de suspension cellulaire par puits d’une plaque de 24 puits contenant le mélange de transfection.

Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire et ne pas les déranger pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine, et retournez les cellules dans l’incubateur.