Northern Blot pour détecter et quantifier des microARN spécifiques dans l’extrait d’ARN total de tissus végétaux

Les microARN, les miARN, sont de petits ARN monocaténaires, non codants. Les miARN s’incorporent dans un complexe multiprotéique et se lient davantage à des séquences d’ARNm cibles complémentaires pour réguler négativement l’expression des gènes.

Pour détecter des miARN spécifiques à partir de l’ARN total des tissus végétaux, ajoutez un colorant de chargement de gel contenant des colorants de suivi et du formamide - un agent dénaturant de l’ARN. Chauffer l’échantillon pour dénaturer l’ARN et empêcher la formation de structures secondaires avant l’électrophorèse.

Chargez l’échantillon et les marqueurs d’ARN standard dans les puits d’un gel de polyacrylamide dénaturant pré-assemblé. Exécutez l’électrophorèse, facilitant la séparation des fragments d’ARN en fonction de la taille.

Transférez le gel sur des papiers filtres pré-humides sur une cassette d’électrobuvard. Alignez une membrane buvard en nylon imbibée de tampon sur le gel. Ensuite, empilez les papiers-filtres pré-humides. Effectuez l’électrobuvardage.

Le courant électrique fait sortir l’ARN chargé négativement, y compris le miARN, du gel sur la surface de la membrane de nylon chargée positivement. Exposer la membrane à la lumière ultraviolette ; cela réticulent les ARN à la membrane, empêchant ainsi la perte d’ARN.

Incuber la membrane dans un tampon d’hybridation contenant des agents bloquants qui occupent les sites de liaison non spécifiques pour réduire le bruit de fond.

Ajoutez une sonde oligonucléotidique d’ARN radiomarquée complémentaire au miARN cible pour se lier spécifiquement à celui-ci. Lavez la membrane avec un tampon, en enlevant les sondes non liées.

Utiliser un système d’imagerie au phosphore pour détecter et quantifier les intensités des signaux d’hybridation radioactive. Le signal à haute résolution indique l’expression spécifique de miARN dans le tissu végétal.