Name: Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Apprenez à visualiser le transport axonal in vivo dans les larves de Drosophila en utilisant la microscopie à fluorescence. Cette technique permet d'étudier les vésicules synaptiques marquées au GFP et de comprendre les mécanismes neuronaux.

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SG est soutenu par des fonds de l&#39;Université d&#39;État de New York à Buffalo et de la Fondation John R. Oishei. MK a été soutenu par une bourse de recherche par curca UB.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer la préparation du tampon de dissection en ajoutant les composés suivants: 128 mM de NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM de MgCl2, 2 mM de KCl, HEPES 5 mM, et 36 mM de saccharose en 1000 ml, pH à 7,2 et stériliser par filtration. </li></ol> 2. Préparation de la dissection <ol><li> Cube Siligard: Le gel est coupé à environ un pouce de largeur, 1 cm de long et environ 1cm de haut. Le cube de gel est placé sur une lame de verre lors de la dissection. Cubes peuvent être utilisés plusieurs fois. </li><li> Pins: Pins utilisés pour la dissection doit être extra court. La partie inférieure forte de broches minutien fonctionne mieux dans la dissection. </li><li> Besoin d'une paire de ciseaux pointus de printemps de microdissection. </li><li> Besoin deux beaux pince à pointe. </li></ol> 3. Collecte des larves <ol><li> Errant 3 e stade larvaire qui sont expression d'une protéine GFP vésicules marquées sont recueillies sur une boîte de Pétri. </li><li> Les larves sont lavées à l'eau déminéralisée pour se débarrasser de tous les aliments. </li></ol> 4. Une dissection en direct des larves <ol><li> Une larve est transféré au cube de gel de dissection sur une lame de verre. Larve est immergé dans un tampon de dissection. </li><li> Larve se languissait à l'antérieur et postérieur au moyen de deux broches fines avec la face dorsale en place. </li><li> Avec des ciseaux de microdissection, une petite incision est faite sur la ligne médiane à proximité de l'extrémité postérieure. A partir de cette incision une coupe est faite par le biais à l'antérieur. En utilisant deux broches, la broche la cuticule couper sur les bords latéraux. </li><li> Ajouter une goutte de dissection tampon. Retirer délicatement le tube digestif, les intestins et corps gras avec une pince. La plupart de ces tissus normalement suinter pendant la coupe dorsale. </li><li> Remplacer le tampon avec un tampon de dissection douce. La larve ne doit jamais être sec et doit être constamment à disséquer tampon. </li><li> Les incubations utilisant des marqueurs in vivo ou Mitotracker Lysotracker sont faites à cette époque, en diluant l'un marqueur in vivo dans un tampon de dissection. Après l'incubation des marqueurs in vivo dans le lavage de la larve disséquée à plusieurs reprises (5 lavages rapides) à l'aide du tampon frais de dissection. </li><li> Après avoir remplacé le dernier lavage pousser les goupilles dans les syligard et immédiatement lamelle. Les larves est maintenant prêt pour l'observation. </li></ol> 5. Imagerie en temps réel des larves disséquées <ol><li> Placez la lamelle et gel sur la platine du microscope et de l'image à l'aide d'un microscope inversé. </li><li> Nous utilisons un objectif 100x à des vésicules Tagged Image au sein des larves nerfs segmentaires. Expression de la GFP dans les corps cellulaires du ganglion ventral est d'abord évaluée avant que les nerfs segmentaires sont imagés. Si coloration GFP robustes est observée dans les corps cellulaires dans le ganglion ventral, les nerfs sont ensuite numérisés et utilisés pour l'évaluation. </li><li> En utilisant un système Dual View avec des filtres pour CFP / YFP ou DP / YFP et logiciels affichage fractionné, nous pouvons simultanément image en deux protéine marquée in vivo. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1:. Une image représentative montrant de nombreuses vésicules axonales sur de nombreuses pistes axonale au sein d'un nerf segmentaire larvaires Notez les blobs de la GFP, ce qui représente des accumulations axonale. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Une image représentative montrant une seule piste axonale avec de nombreuses vésicules axonales au sein d'un nerf segmentaire larvaires.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

L&#39;imagerie in vivo du transport des vésicules synaptiques dans les nerfs des larves de drosophile segmentaire est un outil puissant pour étudier les mécanismes de transport axonal. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour évaluer la dynamique de transport dans les nerfs des larves exprimer élargi répète polyQ à élucider comment l&#39;expansion de répétitions affecter la dynamique des trois transport vésiculaire. En utilisant ce protocole la vitesse de déplacement des vésicules ...

<table><tbody><tr><td>1 paire de ciseaux de dissection microchirurgicaux</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Ciseaux à ressort &amp;#8211; lame de 6 mm. Diamètre de la pointe : 0,125 mm</td></tr><tr><td>2 paires de pinces</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pinces micro-dissection Fisherbrand à extrémité striée Adson</td></tr><tr><td>Boîte d'épingles de dissection</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Épingles Minutien, diamètre 0,1 mm</td></tr></tbody></table>

visualisation in vivo des vésicules synaptiques dans drosophila larves axones segmentaire

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Élucider les mécanismes du transport axonal a montré pour être très important pour déterminer comment les défauts de transport de longue distance affectent différentes maladies neurologiques. Défauts dans ce processus essentiel peut avoir des effets néfastes sur le fonctionnement neuronal et le développement. Nous avons développé un protocole de dissection qui est conçu pour exposer les<em&gt; Drosophile</em&gt; Larvaires nerfs segmentaires pour voir le transport axonal en temps réel. Nous avons adapté ce protocole pour l&#39;imagerie en direct de celui publié par Hurd et Saxton (1996) utilisé pour immunolocalizatin des larves de nerfs segmentaires. Une dissection minutieuse et conditions de tampon adéquate sont essentiels pour maximiser la durée de vie de la larve disséquée. Lorsqu&#39;il est correctement fait, les larves ont montré disséqué transport vésiculaire robuste pour 2-3 heures dans des conditions physiologiques. Nous utilisons la méthode UAS-GAL4<sup&gt; 1</sup&gt; Pour exprimer la GFP taggés APP ou vésicules synaptotagmine au sein d&#39;un seul axone ou axones de nombreuses larves de nerfs segmentaires en utilisant différents neurones GAL4 conducteurs. D&#39;autres marqueurs fluorescent marqués, par exemple mitochondries (Mitotracker) ou les lysosomes (Lysotracker), peut aussi être appliqué aux larves avant la visualisation. GFP-vésicule mouvement et le mouvement des particules peuvent être affichées simultanément à l&#39;aide des longueurs d&#39;onde distinctes.

Ce protocole traite de la dissection en direct de<em&gt; Drosophile</emLarves&gt; dans le but de l&#39;imagerie du mouvement de la GFP taggés vésicules axonales sur les pistes des microtubules.

Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire

L'élucidation des mécanismes du transport axonal s'est avérée être d'une importance cruciale pour déterminer comment les défauts du transport à longue distance affectent différents...

Pour étudier si des défauts du transport axonal à longue distance sont présents dans des maladies neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Huntington. Le transport axonal des vésicules de transport est observé en direct chez des larves d'œsophage. Ici, en train de s'interroger.Des larves au troisième stade exprimant une protéine physique marquée par une GFP sont disséquées sur un cube de gel, puis transférées au microscope pour une imagerie in vivo. Une microscopie de fluorescence est ensuite utilisée pour suivre le transport sical au sein de l’axone. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la visualisation en temps réel du mouvement non perturbé des vésicules synaptiques et des axones larvaires.Préparez la dissection en vous assurant que les fournitures et réactifs suivants sont prêts. Tampon de dissection. Un cube de garde Sill découpé d'un pouce de large, d'un pouce de long et d'un centimètre de haut, placé sur une lame de verre.Épingles de dissection extra courtes. La partie inférieure pointue des épingles manum convient le mieux à la dissection. La longueur appropriée peut être obtenue en insérant des épingles plus longues dans le gel et en coupant toute partie de l'épingle qui dépasse.Vous aurez également besoin d'une paire de ciseaux à ressort fins pour microdissection, ainsi que de deux paires de pinces à pointe fine. Utilisez une petite spatule métallique pour transférer les larves de troisième stade exprimant une protéine SLE marquée par GFP vers une boîte de Pétri.Ensuite, appliquez de l'eau déionisée sur les larves dans la boîte de Pétri afin d'éliminer tout le milieu de culture. Puis, à l'aide de pinces, transférez-les vers un cube de gel pour dissection afin d'effectuer la dissection sur animal vivant. Utilisez les pinces pour transférer une larve vers le cube de gel de dissection.Sur une lame de verre, ajouter du tampon de dissection sur la lame afin de l'immerger. Ensuite, épingler la larve aux extrémités antérieure et postérieure, côté dorsal vers le haut. À l’aide de ciseaux de microdissection, effectuer une petite incision au niveau de la ligne médiane près de l’extrémité postérieure.À partir de cette incision, effectuez une autre coupure en direction de l'antérieur. Les intestins et les corps gras s'écouleront sous l'effet de deux épingles. Fixez la cuticule découpée aux bords latéraux du cube de garde en silice.Utilisez une pipette pour ajouter une goutte de tampon de dissection. Ensuite, à l’aide de pinces, retirez soigneusement les intestins et les corps gras. Appliquez un essuie-tout d’un côté de la larve pour éliminer le tampon tout en ajoutant simultanément du tampon de dissection frais à l’aide d’une pipette.La lave ne doit jamais être sèche. Pour marquer les structures mitochondriales ou lysosomales dans la lave, remplacez le tampon de dissection par un tampon de dissection contenant un traceur mito ou un traceur lyo. Placez le cube de dissection dans une chambre carrée humidifiée et recouvrez-le de papier d'aluminium.Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Après l'incubation du marqueur in vivo, absorber à plusieurs reprises le tampon de dissection entourant les larves et ajouter davantage de tampon de dissection à l’aide d’une pipette. Répéter cette opération cinq fois afin d’éliminer tout marqueur résiduel.Après avoir effectué le dernier lavage, insérez complètement les broches dans la garde S et placez immédiatement une lame couvre-objet afin d'éviter tout déplacement de la larve. La larve est désormais prête à être observée pour réaliser un examen en direct des vésicules marquées sur la larve disséquée. Placez l'échantillon sur la platine d'un microscope inversé afin d'observer les vésicules marquées.Dans les nerfs segmentaires larvaires. Réaliser l’imagerie à l’aide d’un objectif de 100 fois. Si la coloration GFP est robuste, on observe les corps cellulaires dans l’image du ganglion ventral, les nerfs segmentaires à l’aide d’un système à double vue équipé de filtres pour C-F-P-Y-F-P ou R-F-P-Y-F-P, et grâce à un logiciel de vue séparée, deux protéines marquées in vivo peuvent être visualisées simultanément.Dans cette série en lapse de temps, de nombreuses vésicules axonales apparaissent sur plusieurs trajets axonaux au sein d'un nerf segmentaire larvaire. Remarquez que la GFP, marquant les accumulations axonales, révèle également le mouvement bidirectionnel des vésicules. Ici, on observe le déplacement de vésicules axonales sur un unique trajet au sein d'un nerf segmentaire larvaire.Remarquez que le mouvement bidirectionnel de ces vésicules est en moyenne d'un micron par seconde. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une dissection propre permettant l'observation in vivo de vésicules marquées avec GFP et d'axones larvaires gso.

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