Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire
15 octobre 2010
Ce protocole traite de la dissection en direct de Drosophile dans le but de l'imagerie du mouvement de la GFP taggés vésicules axonales sur les pistes des microtubules.
Pour étudier si des défauts du transport axonal à longue distance sont présents dans des maladies neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Huntington. Le transport axonal des vésicules de transport est observé en direct chez des larves d'œsophage. Ici, en train de s'interroger.
Des larves au troisième stade exprimant une protéine physique marquée par une GFP sont disséquées sur un cube de gel, puis transférées au microscope pour une imagerie in vivo. Une microscopie de fluorescence est ensuite utilisée pour suivre le transport sical au sein de l’axone. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la visualisation en temps réel du mouvement non perturbé des vésicules synaptiques et des axones larvaires.
Préparez la dissection en vous assurant que les fournitures et réactifs suivants sont prêts. Tampon de dissection. Un cube de garde Sill découpé d'un pouce de large, d'un pouce de long et d'un centimètre de haut, placé sur une lame de verre.
Épingles de dissection extra courtes. La partie inférieure pointue des épingles manum convient le mieux à la dissection. La longueur appropriée peut être obtenue en insérant des épingles plus longues dans le gel et en coupant toute partie de l'épingle qui dépasse.
Vous aurez également besoin d'une paire de ciseaux à ressort fins pour microdissection, ainsi que de deux paires de pinces à pointe fine. Utilisez une petite spatule métallique pour transférer les larves de troisième stade exprimant une protéine SLE marquée par GFP vers une boîte de Pétri.
Ensuite, appliquez de l'eau déionisée sur les larves dans la boîte de Pétri afin d'éliminer tout le milieu de culture. Puis, à l'aide de pinces, transférez-les vers un cube de gel pour dissection afin d'effectuer la dissection sur animal vivant. Utilisez les pinces pour transférer une larve vers le cube de gel de dissection.
Sur une lame de verre, ajouter du tampon de dissection sur la lame afin de l'immerger. Ensuite, épingler la larve aux extrémités antérieure et postérieure, côté dorsal vers le haut. À l’aide de ciseaux de microdissection, effectuer une petite incision au niveau de la ligne médiane près de l’extrémité postérieure.
À partir de cette incision, effectuez une autre coupure en direction de l'antérieur. Les intestins et les corps gras s'écouleront sous l'effet de deux épingles. Fixez la cuticule découpée aux bords latéraux du cube de garde en silice.
Utilisez une pipette pour ajouter une goutte de tampon de dissection. Ensuite, à l’aide de pinces, retirez soigneusement les intestins et les corps gras. Appliquez un essuie-tout d’un côté de la larve pour éliminer le tampon tout en ajoutant simultanément du tampon de dissection frais à l’aide d’une pipette.
La lave ne doit jamais être sèche. Pour marquer les structures mitochondriales ou lysosomales dans la lave, remplacez le tampon de dissection par un tampon de dissection contenant un traceur mito ou un traceur lyo. Placez le cube de dissection dans une chambre carrée humidifiée et recouvrez-le de papier d'aluminium.
Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Après l'incubation du marqueur in vivo, absorber à plusieurs reprises le tampon de dissection entourant les larves et ajouter davantage de tampon de dissection à l’aide d’une pipette. Répéter cette opération cinq fois afin d’éliminer tout marqueur résiduel.
Après avoir effectué le dernier lavage, insérez complètement les broches dans la garde S et placez immédiatement une lame couvre-objet afin d'éviter tout déplacement de la larve. La larve est désormais prête à être observée pour réaliser un examen en direct des vésicules marquées sur la larve disséquée. Placez l'échantillon sur la platine d'un microscope inversé afin d'observer les vésicules marquées.
Dans les nerfs segmentaires larvaires. Réaliser l’imagerie à l’aide d’un objectif de 100 fois. Si la coloration GFP est robuste, on observe les corps cellulaires dans l’image du ganglion ventral, les nerfs segmentaires à l’aide d’un système à double vue équipé de filtres pour C-F-P-Y-F-P ou R-F-P-Y-F-P, et grâce à un logiciel de vue séparée, deux protéines marquées in vivo peuvent être visualisées simultanément.
Dans cette série en lapse de temps, de nombreuses vésicules axonales apparaissent sur plusieurs trajets axonaux au sein d'un nerf segmentaire larvaire. Remarquez que la GFP, marquant les accumulations axonales, révèle également le mouvement bidirectionnel des vésicules. Ici, on observe le déplacement de vésicules axonales sur un unique trajet au sein d'un nerf segmentaire larvaire.
Remarquez que le mouvement bidirectionnel de ces vésicules est en moyenne d'un micron par seconde. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une dissection propre permettant l'observation in vivo de vésicules marquées avec GFP et d'axones larvaires gso.
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Aperçu
Ce protocole décrit la dissection en direct de larves de Drosophila afin d'observer le déplacement de vésicules axonales marquées par la GFP sur des pistes de microtubules. Cette technique permet de visualiser le mouvement vivant et non perturbé des vésicules synaptiques à l'intérieur des axones larvaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Techniques d'imagerie
Contexte
- Le transport axonal est essentiel au fonctionnement neuronal.
- Les défauts du transport axonal sont associés à des maladies neurologiques.
- Les larves de Drosophila constituent un organisme modèle pour l'étude de ces processus.
- La microscopie à fluorescence permet l'observation en temps réel du déplacement des vésicules.
Objectif de l'étude
- Étudier les défauts du transport axonal à longue distance.
- Comprendre les implications de ces défauts dans les maladies neurologiques.
- Utiliser des techniques d'imagerie en temps réel pour améliorer l'observation.
Méthodes utilisées
- Disséction de larves de Drosophila exprimant des protéines marquées par la GFP.
- Transfert des larves disséquées vers un cube de gel pour assurer la stabilité.
- Imagerie in vivo par microscopie de fluorescence.
- Suivi du transport des vésicules au sein des axones.
Résultats principaux
- Visualisation réussie du transport axonal chez des larves vivantes.
- Démonstration du déplacement de vésicules marquées avec la GFP.
- Apports sur la dynamique du transport des vésicules synaptiques.
- La comparaison avec les méthodes existantes met en évidence les avantages de cette approche.
Conclusions
- Le protocole fournit un outil précieux pour l'étude du transport axonal.
- L'imagerie en temps réel révèle des informations essentielles sur la fonction neuronale.
- Cette méthode peut être appliquée pour étudier diverses affections neurologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La compréhension de la dynamique du transport axonal est essentielle pour réduire les risques associés aux cibles des maladies neurodégénératives, car les anomalies du trafic vésiculaire sont mécaniquement liées à la maladie d'Alzheimer, à celle de Huntington et à la SLA. Ce modèle d'axone larvaire de Drosophila permet une visualisation en temps réel du mouvement des vésicules synaptiques, offrant un système prédictif et pertinent sur le plan des maladies pour la validation précoce des cibles et l'acquisition de connaissances mécanistiques. En quantifiant le flux bidirectionnel des vésicules et les taux de transport, cette méthode appuie les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin dans les programmes précliniques centrés sur l'intégrité axonale.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en visualisant le transport de vésicules marquées par la GFP, comme APP ou la synaptotagmine, dans des axones vivants.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à l'observation directe de la dynamique des vésicules dans un système génétiquement modifiable.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en établliant un lien entre les défauts de transport et le dysfonctionnement neuronal dans des modèles de maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes axonaux validés pour le criblage de composés en établissant une motilité de vésicules de référence dans des conditions physiologiques.
- Valeur opérationnelle : Fournit des mesures quantitatives et reproductibles du déplacement des vésicules (par exemple, un flux bidirectionnel de 1 µm/s) pour la standardisation des tests.
- Valeur stratégique : Permet des protocoles d'imagerie évolutifs et compatibles avec différentes plateformes afin d'évaluer les effets des composés sur le transport axonal.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur des systèmes pertinents pour les maladies en modélisant les défauts de transport observés dans les affections neurodégénératives humaines.
- Valeur opérationnelle : Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique grâce à l'imagerie en temps réel du transport des vésicules dans des nerfs larvaires intacts.
- Atténuation des risques : Éclaire les décisions d'avancement en quantifiant la restauration ou l'aggravation du transport par des modulateurs candidats.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, soutenant la vérification d'hypothèses en phase de découverte précoce, la préparation des tests en criblage et la validation mécanistique en stades précliniques.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques et la réduction des risques biologiques en visualisant le transport des vésicules en réponse à des perturbations génétiques ou pharmacologiques.
- Criblage : Permet la préparation des tests grâce à des protocoles normalisés de dissection, de coloration et d'imagerie, produisant des mesures reproductibles de la motilité vésiculaire.
- Analyse : Génère des mesures quantitatives de variables dépendantes (vitesse, directionnalité, flux) permettant des comparaisons entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure un lien avec la continuité préclinique en modélisant des défauts du transport axonal associés à des maladies neurologiques humaines.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme d'imagerie réutilisable pour des études longitudinales de l'intégrité axonale à travers plusieurs classes de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à la visualisation directe de la dynamique des vésicules synaptiques.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité grâce à des conditions définies de tampon de dissection et de paramètres d'imagerie.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'aller/arrêt en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les hypothèses sur le transport axonal.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur l'efficacité du sauvetage du transport dans des modèles pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation de Drosophila, en microdissection et en microscopie de fluorescence.
- Dépend d'un microscope inversé équipé d'un objectif 100x, d'un système double vue et de jeux de filtres appropriés pour la GFP et d'autres fluorophores.
- Exige une standardisation du tampon de dissection, du stade larvaire et des contrôles environnementaux (chambre humidifiée, température).
- Les adaptations possibles incluent l'expression de différents cargaisons marquées par la GFP (par exemple, mitochondries, lysosomes) à l'aide de promoteurs GAL4 neuronaux.
- Les limitations pratiques comprennent le temps de préparation des larves et la fenêtre de 2 à 3 heures pour un transport vésiculaire robuste après la dissection.
