Injection d'un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

Toutes les 15 secondes, un enfant meurt du paludisme dans le monde. Ici, dans le laboratoire de James, nous essayons de créer des moustiques français incapables de transmettre le parasite du paludisme. Je m'appelle TIUs. Je travaille à l'Université de Californie à Irvine, au sein du Département de Biologie Moléculaire et de Biochimie, dans le laboratoire d'Anthony James.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment produire des yeux transgéniques et non pas de type Stevens. Nous réalisons cette manipulation afin de rendre les moustiques résistants au paludisme, de sorte qu'ils ne puissent plus transporter le parasite du paludisme. J'ai préparé un flacon contenant un tampon isotonique dans lequel les moustiques vont pondre leurs œufs.

Je vais utiliser cet aspirateur pour aspirer les moustiques et les placer dans un flacon. Ce flacon sera ensuite mis dans une incubateur à 30 degrés Celsius, et nous le laisserons environ une heure dans un récipient. Maintenant, nous allons préparer les aiguilles de microinjection.

Il s'agit d'aiguilles en quartz et nous devons utiliser une pointe très fine. Par conséquent, nous avons besoin de ce tire-aiguille. Nous utilisons un tire-aiguille de Suter Instruments ainsi que des aiguilles de Subtle in SU Instruments.

Je sors maintenant les moustiques et je vais déposer ces œufs dans la boîte de Pétri contenant une feuille de papier filtre imprégnée de tampon isotonique, ce qui permet de maintenir les embryons humides pendant la période d'injection. La quantité d'eau sur le papier filtre est critique. Vous ne devez pas que les œufs flottent, ni qu'ils s'assèchent.

Maintenant, je vais déplacer l'embryon du papier d'œuf vers un autre papier Watman de 3 mm qui a été imbibé de tampon isotonique. Je fais cela afin d'éliminer la chorion avant d'aligner les embryons pour la microinjection. Je vais donc retirer la chorion, qui correspond à cette surface argentée des œufs.

Et je fais cela en les brossant avec mon pinceau. Ici, en haut, nous avons un embryon sur lequel le corion est encore en place, avec cette partie brillante argentée. Où est celui du dessous ?

J'ai réussi à retirer le Corian et celui du dessus risque probablement de glisser sur un rubon, tandis que celui du dessous adhérera. Et c'est ce qui est important lorsque vous effectuez un montage sur des côtés inégaux. Maintenant, j'aligne les embryons.

Les embryons sont plus gros à l'extrémité antérieure, que je place à droite. À gauche, j'ai l'extrémité postérieure, plus fine, où je vais injecter les embryons. J'essaie de les rapprocher afin qu'ils s'aident mutuellement à rester en position.

Et habituellement, j'en fais environ 10 en ligne. Maintenant, j'ai une ligne d'embryons que je vais transférer sur une lamelle. Sur la lamelle.

J'ai utilisé du ruban adhésif pour perruque afin qu'ils tiennent. Une fois terminé, je sèche le papier filtre sur lequel se trouvent les embryons à l'aide d'un autre papier filtre, place les embryons sur la lamelle et laisse sécher pendant 30 secondes avant d'appliquer l'huile. Maintenant, nous avons aligné les embryons et ils sont sous l'huile.

Sur la platine du microscope, nous allons injecter de l'ADN mélangé à un colorant alimentaire à l’aide de cette pointe spéciale du motif microbien, puis injecter celui-ci dans les aiguilles du port. Nous avons maintenant rempli l’aiguille et nous l’avons remise sur un micro-injecteur. Nous sommes désormais prêts à effectuer les micro-injections.

Maintenant, je déplace l’aiguille pour l’aiguiser et je l’ajuste afin de l’avoir au point. Une fois cette étape terminée, je déplace l’aiguille de poids et je place les embryons en les mettant au point également. Et lorsque cela est fait, je déplace de nouveau l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit bien positionnée, puis je passe aux embryons.

Maintenant, lorsque l'aiguille traverse l'huile, l'image devient floue et vous devez à nouveau l'ajuster. C'est exactement cela, requin. Exactement, tique de requin.

Et maintenant, je suis prêt à effectuer les injections. Vous pouvez voir que j'ai touché l'embryon avec l'aiguille, et ce faisant, j'ai cassé la pointe, ce qui fait apparaître une petite goutte qui sera injectée dans l'embryon. Il faut donc injecter puis retirer l'aiguille.

Et à chaque fois, entre chaque embryon, je vérifie qu'une petite goutte apparaît à l'extrémité de l'aiguille. Comme vous pouvez le voir, je dois réajuster la position pour chaque embryon afin d'obtenir une position parfaitement alignée. Celui-ci fuyait.

Comme vous pouvez le voir, lorsque je réalise ma deuxième injection dans l'huile, la bulle devient très grande et je dois réajuster la pression du micro-injecteur. Nous avons maintenant terminé les micro-injections et nous allons transférer les embryons du microscope vers la boîte de Pétri, que nous avons remplie avec un tampon isotonique. J'essuierai l'huile du lamelle et je la découperai en un petit morceau, que je déposerai dans la boîte de Pétri.

Nous allons maintenant les laisser ici jusqu'à la fin de la journée, à température ambiante. Ensuite, nous les transférerons dans l'insectarium. Aujourd'hui, je vous ai montré comment injecter un ADN plasmidique dans un œuf de moustique afin d'obtenir des moustiques transitoires.

Et maintenant, nous devons simplement attendre que toutes les larves éclosent. Nous les élèverons jusqu’au stade adulte, puis elles s’accoupleront. Après cela, nous devrons attendre trois semaines avant de pouvoir commencer un criblage pour déterminer si elles sont remodelées ou non.