Name: Injection dun. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Découvrez la microinjection d'embryons d'Anopheles stephensi pour créer des moustiques transgéniques résistants au paludisme. Cette technique contribue au développement de stratégies de lutte contre le malaria.

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Préparation à l&#39;avance de la micro-injection: <ol><li> Moustiques nourrissent de sang: pour l&#39;injection du lundi au mercredi femelles se nourrissent le vendredi précédent. Pour injecter jeudi et vendredi, les femelles se nourrissent le lundi de la même semaine. </li><li> Préparer les aiguilles à quartz utilisant le programme 2 et tampon isotonique (voir matériaux). </li><li> &quot;Pose du tube&quot; pour les embryons est le flacon de culture régulière drosophile. Coton humide dans le fond, avec un disque de papier filtre humide qui la recouvre. </li><li> Préparer lamelle en plastique en collant double-face de la cassette à une extrémité. Bande de garniture à lamelle afin qu&#39;elle se termine au bord de lamelle. </li><li> Préparer l&#39;huile pour la dessiccation. </li><li> Préparez une boîte de Pétri avec tampon isotonique de transférer les embryons à couver. </li></ol> Mise en place de la pose forcée: <ol><li> Recueillir le sang de 60 à 10 femelles nourries avec l&#39;utilisation d&#39;un aspirateur et de les transférer dans le flacon de culture de drosophiles avec du coton et du papier filtre humide avec tampon isotonique. </li><li> Les moustiques sont ensuite remis en conditions insectery dans l&#39;obscurité et autorisés à pondre des oeufs pendant 1 h et 15 min. </li><li> Laissez adultes volent dans la cage et retirez le disque de papier filtre avec des embryons. </li><li> Pour aligner les œufs, le faire sous la portée de dissection. Recueillir des grappes d&#39;oeufs avec un pinceau fin (Sable, No 0000) et le transfert à un carré préparés de papier Whatman 3MM imbibé de tampon isotonique. Conservez le papier tous les temps humides. Ne laissez pas les œufs se dessèchent. Retirez le exochorion avec le pinceau, il aide à mieux coller les oeufs sur la bande. </li><li> Utiliser fines pince n ° 5 ou un pinceau fin, ramasser embryons gris foncé et d&#39;organiser en ligne sur le carré du papier Whatman 3MM humide avec un tampon isotonique. Line up de 20 à 30 embryons. Tous les embryons doivent être dans la même orientation que l&#39;injection doit être au pôle postérieur. L&#39;extrémité antérieure de l&#39;embryon est légèrement plus large que le postérieur. Puis, en utilisant des bandes de papier Whatman 3MM, sécher le filtre où les œufs sont alignés en appuyant fort sur les deux côtés de la ligne d&#39;oeuf, ne pas toucher les oeufs. </li><li> Pour transférer les œufs, inverser la diapositive contenant le ruban adhésif double face (Médecine), et appuyez doucement contre les oeufs. L&#39;extrémité postérieure des œufs doivent être très proches du bord de l&#39;adhésif double face. L&#39;humidité du papier est essentiel pour cela, si elle est trop humide, ils ne collent pas. Je ne la dessiccation des embryons de la deuxième 5-10, mais le temps de dessiccation dépend de l&#39;humide et la température dans la chambre de la micro-injection. </li><li> La dessiccation est cruciale pour les oeufs: peu trop et les embryons ne seront pas éclore. Sans l&#39;ADN de dessiccation n&#39;est pas d&#39;entrer dans l&#39;embryon. </li><li> Couverture embryons desséchés avec de l&#39;huile d&#39;halocarbures pour éviter la dessiccation plus loin. </li></ol> Microinjection des embryons: L&#39;aspect le plus important de l&#39;injection est la qualité de l&#39;aiguille (voir note). <ol><li> Remplir une seringue avec la solution d&#39;ADN à injecter en utilisant un microloader (Eppendorf # 5242 956,003). Très peu d&#39;injection soliution est nécessaire, 1 à 2 ml. </li><li> Connectez l&#39;aiguille à la Transjector Eppendorf, qui contrôle le temps d&#39;injection et de pression, ainsi que la contre-pression. La microinjection est réalisée à l&#39;aide d&#39;un microscope avec une scène en mouvement (Leica) à un grossissement x 10 et micromanipulateur (Leica). Si nécessaire, une platine de microscope soulevées peuvent être préparés par l&#39;empilement de lames de microscope 4-5. Placer la lamelle transportant des embryons sur scène surélevée. Les embryons sont injectés à un angle de 150 °; pénétration doit être au pôle postérieur. Pour l&#39;injection, je garde l&#39;aiguille immobile et déplacer le platine du microscope. Lorsque l&#39;aiguille est nouveau, la pointe est scellée et les pauses habituellement dans la première injection. Je travaille toujours sur la pression nécessaire pour expulser une petite goutte d&#39;ADN dans l&#39;huile entre chaque injection. </li><li> J&#39;ai mis du temps d&#39;injection de 0,2 à 0,9 sec et 1000 hPa lorsque l&#39;aiguille est nouveau. Je varie la pression et le temps jusqu&#39;à ce qu&#39;une gouttelette est petite vu sortir de l&#39;aiguille dans l&#39;huile. La contre-pression doit être réglée à environ 100. Comme l&#39;aiguille s&#39;use, la pression d&#39;injection doit être réduite pour garder le faible volume d&#39;injection (environ 300 hPa). Après cela, la pointe de l&#39;aiguille est trop grande et tue la plupart des embryons de l&#39;. </li><li> Après l&#39;injection, enlever l&#39;huile avec du papier absorbant et recouvrir la lame avec les embryons et les placer dans la boîte de Pétri avec le tampon isotonique. Placez les plats dans le insectory et les y laisser jusqu&#39;à ce que les embryons éclosent. Ils commencent à éclore après 2-6 jours. Transfert aux larves de l&#39;eau distillée avec la pincée de nourriture pour poissons sol. </li></ol> Remarques L&#39;ADN pour l&#39;injection: la solution pour injection d&#39;ADN plasmidique a été isolé en utilisant Endofree kit plasmide.Construire le plasmide et mélanger plasmide assistant ensemble dans la bonne concentration, précipité à l&#39;isopropanol. Le culot a été lavé avec de l&#39;éthanol 70% avant la remise en suspension dans le tampon d&#39;injection. Avant l&#39;injection, l&#39;ADN propre à l&#39;aide Millex-GV colonne. Buffer Izotonic: <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 1,68 M de NaCl - 88,3 ml 1,68 M de NaCl - 2,9 m 1 M HEPES -10,7 ml 1,12 M CaCl 2 à 2,2 ml dH 2 O - 896 ml </td><td> OU </td><td> NaCl 5 M - 29,67 ml 1 M KCl - 4,87 ml 1 Hepes M - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2 à 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml </td></tr></tbody></table> Ajuster à pH 7,2

<table><tbody><tr><td>Aiguilles en quartz pour injection</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Préparées à partir de capillaires de 1,0 mm de diamètre extérieur, 0,70 mm de diamètre intérieur et 10 cm de longueur, étirés en une pointe fine de 3 à 8 µm à l’aide d’un tireur de micropipettes, avec une tige d’environ 100 à 300 mm.</td></tr><tr><td>Tireur de quartz</td><td>Outil</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>Paramètres : Chaleur-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141</td></tr><tr><td>Kit de plasmide EndoFree</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne Millex-GV</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>Pour la purification de l’ADN</td></tr><tr><td>ADN du vecteur</td><td></td><td></td><td></td><td>0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Plasmide auxiliaire</td><td></td><td></td><td></td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>Solution d’injection</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>Solution 1x : 5 mM KCl, 0,1 mM phosphate de sodium, pH 6,8</td></tr><tr><td>Tampon isotonique</td><td></td><td></td><td></td><td>Voir la recette dans la section du protocole</td></tr><tr><td>Huile de dessiccation</td><td></td><td></td><td></td><td>Huile Halocarbon 700 : huile Halocarbon 27 (1:1). Bien mélanger. Préparer à l’avance avant l’injection microscopique.</td></tr><tr><td>Sang</td><td></td><td></td><td></td><td>Pour nourrir les moustiques</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Moustiques, mâles et femelles.</td></tr><tr><td>Flacon de culture de Drosophile</td><td></td><td></td><td></td><td>Pour la ponte des œufs</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td></td><td></td><td></td><td>Avec tampon isotonique, pour l’éclosion des embryons</td></tr><tr><td>Pinceau fin</td><td></td><td></td><td></td><td>Sable # 0000</td></tr><tr><td>Papier Whatman 3MM</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinces #5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhésif double face</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Transjector</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Avec plateau mobile et micromanipulateur, réglé à un grossissement de 10x</td></tr></tbody></table>

injection d&#39;un. embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

L&#39;introduction de gènes exogènes dans les génomes des moustiques nécessite des techniques de micro-injection adaptés aux espèces d&#39;intérêt particulier. Ce protocole vidéo montre une méthode utilisée par le laboratoire de James microinject constructions d&#39;ADN dans des embryons stephensi Anopheles pour la génération de moustiques transformé. Les techniques de préparation des aiguilles de microinjection, la collecte et la préparation des embryons et l&#39;exécution des micro-injection sont illustrés.

Moustiques Anopheles stephensi sont des vecteurs de la malaria qui habitent en Inde et en Asie. Cette vidéo montre la technique pour effectuer des micro-injections de cette espèce avec des transgènes qui confèrent une résistance à la malaria au moustique. Une grande partie de la méthodologie démontrée dans cette vidéo est applicable à des techniques de micro-injection d&#39;autres espèces de moustiques.

Injection d&#39;un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

L'introduction de gènes exogènes dans le génome des moustiques nécessite des techniques de microinjection adaptées à l'espèce spécifique étudiée. Ce...

Toutes les 15 secondes, un enfant meurt du paludisme dans le monde. Ici, dans le laboratoire de James, nous essayons de créer des moustiques français incapables de transmettre le parasite du paludisme. Je m'appelle TIUs. Je travaille à l'Université de Californie à Irvine, au sein du Département de Biologie Moléculaire et de Biochimie, dans le laboratoire d'Anthony James.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment produire des yeux transgéniques et non pas de type Stevens. Nous réalisons cette manipulation afin de rendre les moustiques résistants au paludisme, de sorte qu'ils ne puissent plus transporter le parasite du paludisme. J'ai préparé un flacon contenant un tampon isotonique dans lequel les moustiques vont pondre leurs œufs.Je vais utiliser cet aspirateur pour aspirer les moustiques et les placer dans un flacon. Ce flacon sera ensuite mis dans une incubateur à 30 degrés Celsius, et nous le laisserons environ une heure dans un récipient. Maintenant, nous allons préparer les aiguilles de microinjection.Il s'agit d'aiguilles en quartz et nous devons utiliser une pointe très fine. Par conséquent, nous avons besoin de ce tire-aiguille. Nous utilisons un tire-aiguille de Suter Instr

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L&#39;injection d&#39;ARNdb dans Femme Mosquitos aegypti A.

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Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

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Découvrez la microinjection d'embryons d'Anopheles stephensi pour créer des moustiques transgéniques résistants au paludisme. Cette technique contribue au développement de stratégies de lutte contre le malaria.

Injection d'un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

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