Name: Bleu délectrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour lanalyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Découvrez la caractérisation des complexes multiprotéiques par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) à partir de lysats cellulaires. Cette méthode préserve les interactions protéiques pour une analyse précise.

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Nous tenons à remercier Michael Reth, Hermann Schagger, et Margarita Camacho-Carvajal d&#39;appui scientifique. Ce travail a été financé par de la Bildung FORSYS Bundesministerium für Forschung et (BMBF), par BIOSS de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), et soutenu en partie par l&#39;Initiative d&#39;excellence des gouvernements fédéral allemand et de l&#39;Etat (CGC-4, Spemann Graduate School ).

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

Dans cette étude, nous décrivons l&#39;analyse des PPM par BN-PAGE. Une approche 2D est utilisée d&#39;abord PPM séparés dans des conditions natives, puis de continuer à les subdiviser en leurs composants individuels par une deuxième dimension SDS-PAGE. Les échantillons sont préparés à partir de lysats cellulaires. Pour la solubilisation des PPM nombreuses, un détergent approprié est nécessaire, ce qui préserve la structure des complexes protéiques. Ici, nous utilisons 0,1% de Triton X-100. Toutefois, le détergent et sa concentration optimale appropriées doivent être déterminées empiriquement pour chaque PPM. En cas de Triton X-100, par exemple, il a été rapporté que les concentrations de détergent bas permettent l&#39;identification d&#39;une forme dimérique de la F 1 F 0-ATPase complexes (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Supérieur Triton X-100 concentrations, cependant, conduire à la dissociation du dimère et une augmentation correspondante de l&#39;monomère F 1 F 0-ATPase complexes. Ceci est en ligne avec l&#39;un de nos études antérieures, ont été, nous montrons que le complexe récepteur des cellules T multivalents (TCR) est conservée lorsque extrait avec de faibles concentrations de Brij 96, tandis que l&#39;utilisation de plus forte concentration de détergent ou d&#39;un autre appelé des résultats de la digitonine l&#39;extraction des monomères TCR (Schamel, Aréchaga et al. 2005). Détergents couramment utilisés qui peuvent être testés comprennent digitonine (0,5 à 1%), le Triton X-100 (0,1 à 0,5%), Brij 96 (0,1 à 0,5%), ou dodecylmaltoside (0,1 à 0,5%). Ces réactifs sont des détergents non ioniques, qui tendent à être les meilleurs pour la stabilité MPC. Soyez conscient que le contact avec SDS et d&#39;autres détergents puissants doivent être évités (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Dialyse des lysats est nécessaire pour obtenir la séparation MPC dans un BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004.); (Heiss, Junkes et al 2005).. Il semble que l&#39;ajustement de la concentration de sel ou de l&#39;élimination des impuretés de faible poids moléculaire est cruciale pour une grande résolution. Il est à noter que également des préparations de membrane et des PPM, qui ont été immunopurifié et plus tard sur élue à partir de l&#39;anticorps, sont adaptés pour BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). Dans les deux cas, les échantillons n&#39;ont pas à être dialysé pour BN-PAGE de séparation, si lyse membrane ou élution est effectuée dans BN-tampon de lyse. Pour la séparation des protéines par BN-PAGE, le colorant bleu de Coomassie est nécessaire, qui se lie aux protéines non spécifique et les couvre de charges négatives. Ainsi, le bleu de Coomassie permet la mobilité électrophorétique des protéines vers la cathode à pH neutre (Schagger et Jagow 1991); (Schagger, Cramer et al, 1994).. Par ailleurs, le bleu de Coomassie empêche l&#39;agrégation des protéines dans le gel empilage durant l&#39;électrophorèse. Pour BN-PAGE, Coomassie G250 doit être utilisé au lieu du bleu de Coomassie R250 ou colloïdale bleus Coomassie. Avant de lancer une BN-gel, il est nécessaire de s&#39;assurer que le pourcentage du gel s&#39;adapte à la taille attendue de la MPC d&#39;intérêt. Préfabriqué BN-gels avec différents gradients et tampons appropriés sont disponibles commercialement auprès de Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Mais BN-gels peuvent également être préparés en utilisant un mélangeur de gradient avec une pompe persistaltic. Afin de garantir un gradient intactes, le liquide doit s&#39;écouler en permanence pendant la coulée et les bulles doivent être évités. Nous recommandons le chargement des dilutions des échantillons différents sur le gel, car la surcharge peut conduire à la précipitation des protéines au cours du procédé d&#39;électrophorèse. En outre, BN-gels doivent être exécutés à 4 ° C pour prévenir la dégradation des protéines et de garder intactes les PPM. Après BN-PAGE, la visualisation des PPM peut être réalisé par coloration bleu brillant de Coomassie, coloration à l&#39;argent ou d&#39;immunoblot. Bandes de protéines visualisés par coloration au bleu de Coomassie ou en argent sont adaptés à une analyse approfondie par spectrométrie de masse (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). En cas d&#39;immunoblot, les conditions de transfert optimal pour les PPM d&#39;intérêt doivent être déterminées empiriquement. Soyez conscient que le bleu de Coomassie est également transféré au cours d&#39;un buvard BN-gel. Par conséquent, le gel sera incolore après le transfert réussi, tandis que la membrane va exercer une couleur bleue. De plus, il est important de mentionner que chaque anticorps primaire, qui travaille pour la détection après SDS-PAGE, est applicable à immunoblot après BN-PAGE. Il peut arriver que les anticorps ne reconnaissent pas le MPC d&#39;intérêt parce que leur épitope est caché dans la conformation native des protéines. Pour surmonter ce problème, il est possible de dénaturer les protéines au sein du BN-gel avant le transfert en faisant bouillir le gel peu dans le tampon 1x échantillon de SDS. Dans notre exemple, nous n&#39;avons pas l&#39;objet de la BN-gel directement à la détection des bandes de protéines. Au lieu de cela, nous avons divisé le BN-PAGE, séparés par une seconde lysat dimensisur SDS-PAGE. Dans la deuxième dimension sur gel SDS, les protéines monomériques migrer à l&#39;intérieur d&#39;une diagonale hyperboliques due au gel de gradient dans le premier et le gel linéaire dans la deuxième dimension (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Cela permet l&#39;identification facile des PPM, car elles sont localisées en dessous de cette diagonale hyperbolique. Sous-composants d&#39;un MPC distincts sont séparés dans une ligne verticale dans la deuxième dimension SDS-PAGE. Les composants qui sont des constituants des PPM dinstinct plusieurs peuvent être identifiés sur une ligne horizontale en fonction de la taille de la MPC. Cependant, il doit être considéré que les taches plusieurs protéines figurant dans une ligne verticale pourrait aussi faire partie de complexes distincts qui migrent à la même position dans BN-PAGE. La preuve définitive qu&#39;ils sont présents dans la même MPC peut être obtenue par un dosage à base d&#39;anticorps gel de quart de travail. Dans cet essai, lysat cellulaire est incubée avec un anticorps dirigé contre une protéine représentée par l&#39;un des endroits identifiés avant BN-PAGE. Il en résulte un décalage de tous les PPM qui contiennent cette protéine vers une masse moléculaire plus élevée dans la première dimension. D&#39;autres protéines qui sont aussi une partie de ces PPM va subir ce changement de complexes spécifiques et sont donc faciles à identifier dans la deuxième dimension SDS-gel. Non seulement la composition des PPM peuvent être analysés par BN-PAGE, mais aussi la détermination de leur stœchiométrie est possible (et Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. À cette fin, un test NAMOS (native à base d&#39;anticorps mobilité changement de dosage) peut être effectuée. Comme dans le dosage des anticorps gel à base de quart de travail, les lysats cellulaires sont incubés avec des anticorps monoclonaux sous-unité d&#39;anticorps spécifiques. Cela conduit à l&#39;induction de immunoshifts électrophorétique dans les gels BN-, qui permettent l&#39;inférence à partir de la mesure de l&#39;évolution de la stoechiométrie des PPM En guise de conclusion, BN-PAGE est approprié pour l&#39;identification des PPM et la détermination de leur taille, la composition, ainsi que l&#39;abondance relative. Exécutée comme une épreuve NAMOS, il offre également la possibilité de déterminer la stœchiométrie d&#39;une certaine MPC. Compte tenu de son applicabilité générale, cette technique est un outil très utile pour la caractérisation des PPM (Dekker, Müller et al 1996.); (Wittig et Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.); (Wittig et Schagger 2009) .

bleu d&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (bn-page) pour l&#39;analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Complexes multiprotéiques (PPM) jouent un rôle crucial dans la signalisation cellulaire, puisque la plupart des protéines peuvent être trouvés dans des complexes fonctionnels ou réglementaires avec d&#39;autres protéines (Sali, Glaeser et al. 2003). Ainsi, l&#39;étude des réseaux d&#39;interactions protéine-protéine requiert la caractérisation détaillée des PPM d&#39;acquérir une compréhension intégrative des fonctions des protéines et la réglementation. Pour l&#39;identification et l&#39;analyse, les PPM doivent être séparés dans des conditions natives. Dans cette vidéo, nous décrivons l&#39;analyse des PPM par le bleu électrophorèse en gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE). BN-PAGE est une technique qui permet la séparation des PPM dans une conformation native avec une résolution supérieure à celle offerte par filtration sur gel ou d&#39;ultracentrifugation de densité de sucrose, et est donc utile pour déterminer la taille MPC, la composition et l&#39;abondance relative (Schagger et Jagow 1991) ; (Schagger, Cramer et al, 1994).. Par cette méthode, les protéines sont séparées selon leur taille et la forme hydrodynamique dans une matrice de polyacrylamide. Ici, nous démontrons l&#39;analyse des PPM du total des lysats cellulaires, soulignant que la dialyse lysat est l&#39;étape cruciale pour faire BN-PAGE applicables à ces prélèvements biologiques. En utilisant une combinaison de la dimension et la dimension BN-première seconde SDS-PAGE, nous montrons que les PPM séparés par BN-PAGE peut être subdivisée en leurs constituants individuels par SDS-PAGE. Visualisation des composants MPC en cas de séparation du gel est réalisée par immunoblot standard. À titre d&#39;exemple pour l&#39;analyse des PPM par BN-PAGE, nous avons choisi le 19S bien caractérisés eucaryotes, 20S, 26S et de protéasomes.

Dans cette vidéo, nous décrivons la caractérisation de complexes multiprotéiques (PPM) en bleu électrophorèse en gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE). Dans une première dimension, dialysées lysats cellulaires sont séparés par BN-PAGE pour identifier les PPM individuelle. Dans une deuxième dimension SDS-PAGE, PPM d&#39;intérêt sont subdivisées afin d&#39;analyser leurs électeurs par immunoblot.

Bleu d&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour l&#39;analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires

Les complexes multiprotéiques (CMP) jouent un rôle crucial dans la signalisation cellulaire, car la plupart des protéines se retrouvent dans des complexes fonctionnels ou régulateurs avec d'autres...

L'objectif général de l'expérience suivante est de caractériser un complexe MultiPro à partir de lysats cellulaires en utilisant l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu, qui, contrairement à la PAGE-SDS, permet la séparation des protéines dans des conditions natives et préserve les interactions entre protéines. Ceci est réalisé en dialysant le lysat cellulaire afin d'éliminer les sels en excès, rendant l'échantillon compatible avec la séparation par PAGE natif bleu en tant que deuxième étape. Le lysat est appliqué à la première dimension de la PAGE natif bleu, qui sépare les complexes protéiques dans des conditions natives selon leur taille et leur forme.Ensuite, une deuxième dimension. Une électrophorèse SDS dénaturante est réalisée afin de subdiviser les complexes en leurs constituants individuels. Les protéines peuvent être visualisées par coloration argent ou coloration au kumasi, ou par immunotransfert.Ici, les protéines séparées ont été détectées par une coloration argent dans la démonstration suivante ; toutefois, un immunoblot sera utilisé. Bonjour, je suis Brita Bloom du laboratoire de Wolfgang Sharmel, du Département d'Immunologie Moléculaire à l'Institut Max Planck d'Immunobiologie à Fribourg, Allemagne. Bonjour, je suis Dina Fiala.Je viens également du laboratoire Sham. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour l'analyse des complexes MultiPro à partir de lysats cellulaires. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la composition des récepteurs membranaires multissous-unités.Cependant, dans cette vidéo, nous utilisons le protéasome tic comme exemple. Commençons donc. Avant le début de cette procédure, préparez tous les tampons comme décrit dans le protocole écrit et conservez-les à quatre degrés Celsius.Récolter 10 millions de cellules HEC 2 9 3 et les mettre en pellet par centrifugation à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, laver les culots cellulaires avec un millilitre de PBS glacé et utiliser la centrifugation pour faire un pellet des cellules lavées. Répéter ce lavage deux fois, puis resuspendre le culot cellulaire lavé dans 250 microlitres de glace.Bleu froid, lyse natif, tampon, et incuber la suspension sur de la glace pendant 15 minutes. Après l'incubation, centrifuger les cellules vivantes à 13 000 ×g pendant 15 minutes à 4 °C pour éliminer le matériel insoluble. Pendant ce temps, faire fondre un trou dans le bouchon d'un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à l'aide du côté de grand diamètre chauffé d'une pipette à pâtes.Ensuite, placer le tube sur de la glace pour le refroidir jusqu'à quatre degrés Celsius. Une fois la centrifugation terminée, transférer le lysat dans le tube destiné à l'élimination du sel par dialyse. Placer une membrane de dialyse avec une coupure à 10 kilodaltons au-dessus du tube ouvert.Fermez le bouchon et coupez tout excès de membrane de dialyse qui dépasse. Scellez ensuite soigneusement le côté du bouchon avec du parafilm ; une fois scellé, retournez le tube et placez-le à l’envers dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez l’échantillon à la vitesse la plus faible possible pendant 10 secondes.Dans une centrifugeuse pour culture cellulaire, préparez un bécher de 100 millilitres contenant du tampon de dialyse bleu natif froid et un agitateur magnétique, en utilisant au moins 10 millilitres de tampon de dialyse bleu natif par 100 microlitres d'échantillon. Ensuite, retirez le tube inversé du tube conique à l’aide de pinces. Pour éviter de remettre le tube à l’endroit.Fixez le tube avec du ruban adhésif à l’envers dans le bécher et retirez toutes les bulles d’air présentes dans le trou sous le bouchon. À l’aide d’une pipette Pasteur courbée, enclenchez l’agitation magnétique et laissez l’échantillon dialyser pendant six heures ou toute la nuit dans la chambre froide. Vérifiez occasionnellement l’échantillon afin de vous assurer que l’agitation ne crée pas de bulles d’air au niveau de la membrane de dialyse.Après l'incubation, transférez le lysat cellulaire dialysé dans un nouveau tube microcentrifuge prérefroidi et laissez-le sur glace jusqu'au chargement du gel en gradient. La coulée du gel s'effectue à température ambiante à l'aide d'un mélangeur de gradient. Placez le mélangeur de gradient sur une plaque agitatrice et reliez-le à un morceau de tubulure souple.Fermer le canal du mélangeur de gradient à l’aide du robinet et fermer le tube avec une pince. Placer un agitateur magnétique dans le cylindre relié au tube. Ensuite, introduire le tube souple dans une pompe péristaltique et fixer une aiguille de seringue à son extrémité.Ensuite, placer l'aiguille entre les deux plaques de verre en haut de l'appareil de gel. Préparer des solutions de gel de séparation à 4 % et à 15 % de sorte que les volumes combinés soient égaux au volume du gel de séparation. Ajouter un PS et du TM me immédiatement avant.Utilisez et versez les solutions de gel dans les cylindres correspondants du mélangeur de gradient. Ensuite, allumez l'appareil et ouvrez la vanne. Appuyez sur le cylindre gauche pour chasser la bulle d'air présente dans le canal reliant les deux réservoirs de gel.Mettez la pompe en marche à cinq millilitres par minute. Retirez le clamp et laissez le gel s'écouler lentement entre les plaques de verre. Relevez lentement l'aiguille lorsque le gel s'arrête, en veillant à ce que l'aiguille reste toujours au-dessus du liquide.Laisser tout le liquide pénétrer dans l'appareil à gel. Ensuite, recouvrir délicatement le liquide avec de l'isopropanol et rincer l'appareil avec de l'eau distillée. Laisser le gel polymériser pendant au moins 30 minutes à température ambiante.Ensuite, préparez un gel concentrateur à 3,2 %, en ajoutant du PS et du TM juste avant utilisation. Versez le gel concentrateur au-dessus du gel de séparation et insérez le peigne entre les plaques de verre, en évitant les bulles. Une fois la polymérisation du gel concentrateur terminée, refroidissez immédiatement le gel à quatre degrés Celsius avant le chargement de l'échantillon.Retirez la peigne lentement en le tirant selon un angle par rapport au plan du gel. Cela permet à l'air d'entrer rapidement dans les poches, ce qui améliore la qualité des puits pour séparer le lysat cellulaire dialysé par électrophorèse native bleue. Chargez 20 microlitres du marqueur de ferritine et 40 microlitres du lysat dialysé dans les puits vides. À quatre degrés Celsius, les pistes vides sont remplies de volumes équivalents de tampon de dialyse. Ensuite, recouvrez les échantillons dans chaque puits avec du tampon cathodique froid.Remplissez la chambre interne avec un tampon cathodique froid et la chambre alsa avec un tampon anodique froid. Travaillez à quatre degrés Celsius et appliquez 100 volts jusqu'à ce que les échantillons pénètrent dans le gel de séparation. Augmentez ensuite la tension à 180 volts et faites migrer le gel jusqu'à ce que le front coloré atteigne l'extrémité du gel.L'exécution dure de trois à quatre heures. Pour la deuxième dimension SDS-PAGE, préparez un gel SDS standard à 10 % avec une seule grande piste. Une piste pour le marqueur de poids moléculaire et une piste pour un aliquot du témoin de lysat dialysé qui a été mélangé avec du tampon d'échantillonnage SDS et porté à ébullition pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius. Retirez le gel de la PAGE native bleue, toujours entre les plaques, de l'appareil d'électrophorèse et soulevez délicatement l'une des plaques.Retirez le gel de concentration et découpez la bande du gel Blue Native PAGE contenant les protéines d'intérêt. Placez le fragment de gel Blue Native PAGE dans du tampon d'échantillonnage SDS et incubez 10 minutes à température ambiante sous agitation. Après l'incubation, faites bouillir brièvement le fragment de gel au micro-ondes, puis incubez-le à nouveau pendant 15 minutes.Dans le tampon d'échantillonnage SDS sur un agitateur, retirez le peigne du gel SDS et remplissez partiellement de tampon SDS les puits. Chargez la tranche de gel SDS-PAGE bleu natif dans le grand puit du gel SDS, en évitant les bulles d'air. Vous pouvez utiliser une pince pour faciliter la manipulation, car la tranche de gel doit être positionnée précisément sur le gel de concentration.Couvrir la tranche avec du tampon d'échantillonnage SDS, puis charger le marqueur et le témoin de lyzat. Réaliser l'électrophorèse et le transfert des protéines selon les protocoles standards. Pour interpréter les résultats, il est important de savoir que la position d'une protéine dans la deuxième dimension de la gelée SDS native bleue indique si la protéine fait partie d'un complexe MultiPro ou non.Les protéines monomériques migrent selon une diagonale hyperbolique en raison du gel gradient en première dimension, et comme un gel linéaire en seconde dimension ; les sous-unités des complexes MultiPro se retrouvent en dessous de la diagonale, formant une ligne verticale. Si une protéine donnée fait partie de complexes distincts, plusieurs taches sont détectées selon une ligne horizontale. En résumé, l'approche bidimensionnelle de la PAGE bleue native suivie de la PAGE SDS permet de déterminer la composition, la taille et l'abondance relative des complexes MultiPro.Dans cette démonstration, plusieurs protéasomes ou sous-unités ont été détectés par immunotransfert. Les sous-unités bêta deux et MCP 21 pouvaient être détectées sous forme de taches individuelles disposées verticalement, indiquant qu'elles font partie des mêmes complexes. PA 28 se trouve sur une même ligne verticale avec bêta deux et CP 21, et fait donc partie du même complexe.En examinant les lignes horizontales, on peut observer que beta deux et MCP 21 font partie de trois complexes distincts. PA 28 n'est présent que dans l'un de ces complexes. Par conséquent, ces complexes MultiPro pourraient être identifiés comme le protéasome 20 success et le protéasome 20 s.Avec P 28 et le protéasome 20 S seul, nous venons de vous montrer comment séparer et caractériser des complexes MultiPro natifs à partir d'un lysat cellulaire en utilisant l'électrophorèse native sur gel en présence de bleu de Coomassie. Lors de cette procédure, il est important de bien dialyser l'échantillon. Pour éviter tout contact avec le SDS et travailler systématiquement à quatre degrés, nous recommandons de comparer différents détergents pour la lyse cellulaire afin d'assurer à la fois l'intégrité des complexes moteurs et une solubilisation optimale.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences. Je me retire.

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CN-GELFrEE - Clear natif Gel-élué Fraction liquide Entrapment Electrophoresis

Procédé pour la stabilisation et la séparation des complexes de protéines natives à partir de lysat de tissu non modifié en utilisant une protéine réactive amine agent de réticulation couplé à une nouvelle électrophorèse sur gel de polyacrylamide en deux dimensions (PAGE) système est présentée.

Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Nous présentons un protocole afin d’analyser la composition en protéines de grande protéine : protéine native et de protéines : acides nucléiques complexes de colza (b. napus) exsudat de phloème en utilisant une approche d’électrophorèse (PAGE) 3D gel de polyacrylamide combinant bleu natif (BN) avec deux PAGEs de dénaturation suivie d’identification par spectrométrie de masse.

Échantillonnage de Sap de phloème de Brassica napus pour 3D-PAGE des protéines et des Complexes ribonucléoprotéiques

Un protocole pour l’élucidation de l’usine de thylakoïdes organisation complexe de protéines et la composition avec bleu natif polyacrylamide gel électrophorèse (BN-PAGE) et 2D-SDS-PAGE est décrite. Le protocole est optimisé pour l' Arabidopsis thaliana, , mais peut être utilisé pour d’autres espèces de plantes avec des modifications mineures.

Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Ce protocole montre l’analyse des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale par électrophorèse sur gel de polyacrylamide native bleu. La méthode appliquée aux cellules humaines cultivées est décrit ici.

Analyse des Complexes de chaîne respiratoire mitochondriale dans les cellules humaines cultivées à l’aide de bleu sur Native de Gel de Polyacrylamide et Immunoblotting

Découvrez la caractérisation des complexes multiprotéiques par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) à partir de lysats cellulaires. Cette méthode préserve les interactions protéiques pour une analyse précise.

Bleu délectrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour lanalyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal

Bleu d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour l'analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires

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