Souris Transnuclear avec des spécificités T pré-définis Cell Receptor contre Toxoplasma gondii Obtenues par TNCS

Les souris transgéniques pour des récepteurs spécifiques d'antigènes des lymphocytes T se sont révélées indispensables pour l'étude du développement et de la fonction des lymphocytes T afin de générer des modèles murins dotés de spécificités de récepteurs des lymphocytes T prédéfinies en utilisant le transfert nucléaire de cellules somatiques ou SCNT. Une souris est infectée par un agent pathogène d'intérêt. Les lymphocytes T sont isolés à partir de la souris, puis purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence.

Les lymphocytes T purifiés sont ensuite utilisés pour le transfert nucléaire de cellules somatiques. Une fois que les embryons atteignent le stade de blastocyste, les cellules souches embryonnaires sont isolées. Ces cellules sont ensuite injectées dans des blastocystes, qui sont par la suite transférés à des souris pseudo-gestantes.

Les souriceaux résultants expriment une augmentation marquée de la population de lymphocytes T d'intérêt, ce qui peut être validé par une analyse PAX. Bonjour, je m'appelle Okta AK et je suis postdoctorant au White Institute for Biomedical Research. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment réaliser des injections somatiques assistées par transfert CLE et des transferts embryonnaires.

L'avantage principal du transfert somatique est que des modèles murins peuvent être générés, exprimant leur récepteur des lymphocytes T à partir du locus endogène, et donc sous le contrôle du promoteur endogène, et que ces modèles murins peuvent être obtenus très rapidement. Le transfert liquide somatique peut être utilisé comme outil pour générer des modèles murins dotés de spécificités prédéfinies de récepteur des lymphocytes T ou de récepteur des lymphocytes B. Ceci présente un intérêt particulier pour les chercheurs travaillant dans des domaines tels que l'auto-immunité, les maladies infectieuses et le cancer.

Pour isoler des lymphocytes T spécifiques d'un agent pathogène tel que Toxoplasma gondii, les souris infectées sont euthanasiées par injection intrapéritonéale au pic de la réponse immunitaire, la rate est ensuite prélevée de la souris euthanasiée et les cellules donneuses sont homogénéisées, isolées, puis incubées avec des anticorps marqués par fluorescence et le tétramère approprié. Enfin, un tri par cytométrie en flux est effectué afin d'obtenir les lymphocytes T spécifiques du pathogène. La veille de la procédure d'énucléation de l'ovocyte.

Préparez des capillaires d'injection piso de quatre, cinq et sept micromètres en utilisant une seringue pour les charger rétrogradement avec du mercure. Le lendemain, commencez le protocole de transfert nucléaire de cellule somatique en collectant les ovocytes, puis, à l’aide d’une pipette buccale, transférez-les dans des gouttes de milieu K-S-O-M-A-A dans une boîte de Pétri. Dans le couvercle de la boîte de Pétri.

Préparez un plat pour effectuer le transfert nucléaire de cellules somatiques ou SCNT en plaçant environ 10 gouttes de PVP. Ajoutez environ 10 gouttes de HCZB contenant cinq microgrammes par millilitre de cyto B et environ 10 gouttes de HCCB contenant 2,5 microgrammes par millilitre de cyto B. Ce plat sera appelé le plat SCNT-A. Placez le plat SCNT-A sur la platine d'un microscope composé inversé.

Placez ensuite une aiguille d'énucleation de sept micromètres dans le micromanipulateur et rincez-la en aspirant cinq à dix fois une solution de PVP à jeter. Transférez ensuite 10 à 30 cytes bloqués en métaphase II depuis la boîte de Pétri vers l'une des gouttes de HCCB contenant cinq microgrammes par millilitre de Cyto B, sur la plaque S-C-N-T-A. Incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant l'incubation, alignez les ovocytes horizontalement.

Une fois cinq minutes écoulées, utilisez l'aiguille d'énucleation pour placer un ovocyte devant l'aiguille de maintien. À l'aide d'un micro-injecteur, appliquez une aspiration afin de fixer l'ovocyte sur l'aiguille de pipette micrométrique.

Ensuite, à l’aide de l’aiguille d’énucleation, faites pivoter l’ovocyte jusqu’à ce que le complexe fuseau chromosomique, qui apparaît comme étant très transparent par rapport au cytoplasme opaque, soit à la position de trois heures. Déclenchez une impulsion piézo en appuyant sur la pédale afin de pénétrer la zone pellucide. Une impulsion piézo est une impulsion mécanique qui se propage longitudinalement et fait vibrer l’extrémité de l’aiguille d’énucleation. Les vibrations de l’extrémité facilitent le perçage de la zone pellucide.

Une fois passé la zone palita, placez l'ouverture de l'aiguille de nucléation adjacente au fuseau de métaphase II et appliquez le vide. Le complexe chromosomique du fuseau pénétrera lentement dans l'aiguille. Une fois l'aiguille retirée, la membrane doit se refermer d'elle-même.

Enfin, à l’aide d’une pipette buccale, transférez les cytoplastes énucléés dans les gouttes de K-S-O-M-A-A. Ensuite, à l’aide de la même pipette, lavez-les en les transférant de goutte en goutte de KSOM AA. Pour effectuer le transfert nucléaire, remplacez l’aiguille d’énucléation de sept micromètres sur le micromanipulateur par une aiguille de transfert nucléaire de quatre à cinq micromètres. Lavez l’aiguille avec du PVP comme précédemment.

Placer les lymphocytes T CD8 positifs isolés précédemment dans une goutte de PVP sur la plaque S-C-N-D-A. Bien mélanger et incuber au moins 10 minutes à température ambiante. Ensuite, transférer de 10 à 30 cellules NUCLÉÉES dans une goutte de HCZB contenant 2,5 microgrammes par millilitre.

Cyto B sur la lame S ct. Incuber la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant l'incubation, utiliser l'aiguille de transfert nucléaire pour aligner horizontalement les cytes à l'aide de l'aiguille d'injection.

Prélevez une cellule donneuse CD8 positive dans le milieu PVP et aspirez-la plusieurs fois jusqu'à ce que la membrane externe se soit rompue. Si nécessaire, appliquez une impulsion piézo : des fragments de membrane et de cytosol doivent être visibles. Aspirez ensuite le noyau dans l'aiguille.

Ensuite, continuez à prélever des noyaux jusqu'à ce qu'il y en ait de 10 à 30. Puis, déplacez-vous vers la goutte contenant les cytes énucléés alignés. Appliquez le vide pour fixer un ovocyte à l'aiguille de maintien.

Ensuite, placer l'aiguille de transfert nucléaire NU à côté de la zop lucita, les noyaux étant orientés à l'opposé de l'ouverture. Appliquer une impulsion piézoélectrique jusqu'à ce que l'aiguille traverse la zop lucita. Pousser le micromanipulateur pour déplacer délicatement un noyau jusqu'à l'extrémité de l'aiguille.

Introduisez l'aiguille dans l'ovocyte jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille soit insérée aux deux tiers de sa longueur. Appliquez une légère pression négative afin qu'une petite partie de la membrane de l'ovocyte pénètre dans l'aiguille. L'étape suivante est très critique.

Étant donné que c'est le seul moment où l'ovocyte est réellement ouvert, appliquez une seule impulsion ZO. Ensuite, appliquez une pression positive pour expulser le noyau hors de l'aiguille.

Retirez soigneusement l'aiguille afin que la pointe se trouve à environ un tiers à l'intérieur de l'ovocyte, puis appliquez une pression négative et continuez à retirer l'aiguille. Pour sceller l'ovocyte. Répétez cette étape pour chaque ovocyte.

Une fois que tous les ovocytes ont reçu un noyau, transférez-les dans la boîte de Pétri et lavez-les en les déplaçant de goutte en goutte de milieu KS OM AA, puis incubez-les à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Après l'incubation, transférez les embryons SCN T dans des gouttes de milieu d'activation sans calcium contenant du chlorure de strontium. Le chlorure de strontium active l'ovocyte en induisant des oscillations calciques similaires à celles qui se produisent lors de la fécondation.

Incuber pendant six heures. Si désiré, AJOUTER du TSA, qui est un inhibiteur non spécifique des histones diacétylases, dans le milieu d'activation afin d'améliorer l'efficacité après l'activation. Examiner les embryons au microscope inversé pour déterminer la quantité de pseudo-pronoyaux ou d'embryons SCNT positifs pour les PPN. Les PPN peuvent être identifiés selon leur apparence.

Ils ressemblent à des œufs. Mettre à l'air libre côté jaune vers le haut, puis laver et cultiver. Les embryons et les gouttes de K-S-O-M-A-A sont incubés pendant trois jours et demi à 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de blastocyste.

Au départ, vous devez vous concentrer sur l'exécution correcte des procédures que nous venons de vous montrer pour la nucléation et le transfert nucléaire NU. Une fois que vous maîtriserez ces techniques, les procédures suivantes seront plus faciles à réaliser. Les cellules souches embryonnaires, ou cellules ES, utilisées ici ont été obtenues à l'aide de techniques standard.

Elles doivent être préparées le jour de l'injection assistée par souffle, trois jours et demi après le coït. Préparez le couvercle d'une boîte bactériologique stérile en déposant des gouttes contenant du PVP et du HCZP. Préparez ensuite une pipette d'injection de 15 micromètres pour l'impulsion piso comme précédemment.

Ensuite, placez l'aiguille d'injection dans le micromanipulateur et rincez-la avec du transfert PVP. Effectuez 10 à 30 impulsions de blast dans une goutte de HCZB. Puis, déposez cinq à cinquante microlitres de la suspension ESL dans une autre goutte de HCZB.

Il devrait y avoir suffisamment de cellules ES pour qu'elles puissent être facilement prélevées, mais sans être trop nombreuses. Ensuite, prélevez 30 à 100 cellules ES à l’aide de l’aiguille d’injection. Déplacez-vous vers la goutte contenant l’assistance blastocytaire.

Aligner horizontalement l'assistance au blast et fixer celle-ci à l'aide de l'aiguille de maintien en appliquant un vide. Utiliser l'aiguille d'injection pour tourner l'assistance au blast jusqu'à ce que la masse cellulaire interne soit à neuf heures. Placer l'aiguille d'injection à trois heures.

Vérifiez qu'il n'y ait aucune cellule ES à l'extrémité de l'aiguille, puis appliquez une impulsion piso jusqu'à ce que l'aiguille d'injection traverse la zop lucita et la trifecta pour pénétrer dans le blastique scellé. Libérez cinq à quinze cellules ES afin qu'elles s'attachent à la masse cellulaire interne. Poursuivez jusqu'à ce que tous les blast assist aient été injectés, une fois les injections terminées.

Laver deux fois dans du K-S-O-M-A-A et procéder au transfert embryonnaire chirurgical chez des femelles pseudo-gestantes. Placer une souris femelle receveuse pseudo-gestante sous anesthésie dans la zone opératoire. À l’aide d’un rasoir électrique, raser les poils du quadrant inférieur droit. Désinfecter la zone à l’aide d’une solution à base d’iode et d’éthanol à 70 % sous un microscope stéréoscopique.

Utilisez des ciseaux pour ouvrir la peau, puis placez les ciseaux fermés entre la peau et le péritoine et ouvrez-les pour séparer le péritoine de la peau. Localisez l'ovaire à travers le péritoine, qui doit apparaître comme une tache rouge. Ensuite, utilisez les ciseaux pour ouvrir le péritoine dans cette région.

Utilisez une pince pour saisir délicatement le CTU ou la graisse environnante et retirez l'utérus à l’aide d’une capillaire reliée à une pipette buccale. Prélevez un groupe d’environ 10 blastocystes en tenant l’oviducte et l’utérus avec la pince. Utilisez une aiguille pour percer un petit trou dans l’utérus.

Insérez ensuite la capillarité avec l'assistance de blast dans la lumière de l'utérus et libérez-les. Repoussez l'utérus dans la cavité abdominale. Repérez les bords du péritoine et fermez-le par quelques points de suture.

Fermer la peau de la souris à l’aide de quelques agrafes. Administrer un médicament analgésique par voie sous-cutanée. Puis transférer la souris dans sa cage sous une lampe chauffante.

Surveiller la respiration de la souris jusqu'à ce qu'elle se réveille. Après l'énucléation et le transfert nucléaire de cellules somatiques. Environ 70 % des embryons étaient positifs pour les pseudo-pronoyaux.

Comme illustré sur cette figure, le traitement avec TSA pendant six ou dix heures n'a eu aucun effet. Après trois jours et demi de culture, cinq à dix % des embryons se sont développés en blastocystes.

À nouveau, l'ajout de TSA n'a eu aucun effet sur le taux de développement des blastocystes de soutien. Les blastocystes de soutien SCNT ont ensuite été utilisés pour établir des cellules souches embryonnaires. Le TSA a significativement amélioré le taux d'obtention des ESL à partir des blastocystes de soutien.

Les cellules S-C-N-T-E-S sont utilisées pour générer des souris chimériques. Du sang est prélevé chez ces souris et analysé afin de détecter la présence de lymphocytes T spécifiques par cytométrie en flux, comme illustré ici. Lorsque le sang est marqué par un anticorps anti-CD8 et un tétramère spécifique, une population double positive peut être identifiée.

Indiquant que la cellule donneuse utilisée pour le transfert nucléaire d'une cellule somatique était de la spécificité correcte. Je viens de vous montrer comment réaliser le transfert de cellules somatiques, les injections d'assistance blastocystique et le transfert d'embryons. Le point le plus important à prendre en compte est la pureté de vos cellules T ou de vos cellules B.

Une fois que vous aurez appris à réaliser le transfert somatique et que vos embryons seront au stade de blastocyste, vous pourrez choisir entre les transférer directement dans des femelles pseudo-gestantes ou les utiliser pour établir des cellules souches embryonnaires et générer des souris chimériques.