Name: Souris Transnuclear avec des spécificités T pré-définis Cell Receptor contre Toxoplasma gondii Obtenues par TNCS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Découvrez la génération de souris transnucléaires avec récepteurs T spécifiques contre Toxoplasma gondii par transfert nucléaire de cellules somatiques. Cette méthode accélère la création de modèles pour l'étude des maladies infectieuses.

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Les auteurs sont reconnaissants à H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, et G. Yap pour des discussions fructueuses et des réactifs. Nous sommes reconnaissants à J. Dausman, R. Flannery, et J. Jackson pour l&#39;aide à la gestion de la colonie de souris. Nous sommes reconnaissants à P. Wisniewski pour FACSorting. EMF a été soutenu par le Programme scientifique sur la frontière de l&#39;homme. RJ a été soutenue par l&#39;Institut national de bourses en santé RO1-HD045022 et R37-CA084198. HLP a été soutenue par des subventions du National Institute of Health.

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolement des cellules du donneur Avant de T spécifiques ou des cellules B peuvent être utilisés comme les cellules du donneur de générer des modèles de souris Transnuclear, les souris doivent être infecté par un pathogène d'intérêt ou immunisées avec un antigène d'intérêt. Puisque nous avons utilisé les cellules CD8 + spécifiques pour Toxoplasma gondii, le protocole suivant décrira la génération et l'isolement de ces cellules et doit être adaptée en fonction de l'intérêt personnel. <ol><li> Les kystes provenant d'un homogénat de cerveau de souris (environ 40) sont injectés par voie intrapéritonéale en BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) des souris, qui permet l'isolement de deux H-2 b et H-2 d restreint cellules T CD8 +. </li><li> Au pic de la réponse immunitaire, la souris infectées est euthanasié, la rate isolés et placés dans un plat contenant 6 cellules ml de sang rouges (RBC) du tampon de lyse. </li><li> En utilisant les côtés givrés de deux diapositives de couverture, la rate, est soigneusement broyé et incubés dans le tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 14 ml de PBS, filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube Falcon de 50 ml et centrifuger pendant 5 min à 300g. </li><li> Retirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de PBS et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Centrifuger pendant 5 min à 300g et retirer le surnageant par la suite. </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans 50 ul de PBS, ajouter des anticorps marqués par fluorescence pour identifier le type de cellule d'intérêt (par exemple, CD3, B220, CD8 et CD4), et marqué par fluorescence CMH-I tétramère (CMH-II tétramère pour les cellules T CD4) chargée avec le peptide d'intérêt à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 1 mL de PBS, centrifuger pendant 5 min à 300 g de granulés, remettre en suspension dans 3 ml de PBS, et filtrer les cellules en suspension à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube. </li><li> Effectuer FACSorting en définissant les portes rigoureusement (figure 1B). </li></ol> 2. Noyaux de cellules somatiques Il ya quelques protocoles de transfert de noyau de cellule somatique. Celle décrite ici fait usage d'ovocytes arrêtés en métaphase II et l'inhibition de la seconde division méiotique utilisant cytochalasine B. Donc les cellules du donneur sont nécessaires, qui sont en phase de G0/G1. <ol><li> Préparation des ovocytes <ol><li> Des souris femelles BDF1 des antécédents sont injectés par voie intrapéritonéale avec 5IU PMS par souris 17:00-19:00. </li><li> Environ 47 heures plus tard, chaque souris est injecté par voie intra-péritonéale avec HCG 5IU. </li><li> Préparez une boîte de culture (KSOM-AA gouttes sous huile) pour les ovocytes, le même jour que l'injection de HCG et les placer dans une étuve à 37 ° C, 5% de CO 2. En outre, de préparer les aiguilles nécessaires pour SCNT (7μm d'énucléation et 4 ou 5 pm pour le transfert nucléaire de noyaux de lymphocytes) en les chargeant avec le mercure. </li><li> Euthanasier les souris et d'isoler les oviductes environ 13h après l'HCG (environ 8 heures). Recueillir les oviductes de 1-2 gouttes de HCZB. </li><li> Un par un seul mouvement les oviductes dans une goutte contenant M2 w / hyaluronidase. Nick l'oviducte soigneusement avec une pince et déplacer l'ovocyte-cumulus-complexe dans la goutte. Après tout ovocyte-cumulus-complexes ont été isolés, le plat est incubé à 37 ° C. </li><li> Après 2-5 min (le temps exact dépend du lot de hyaluronidase) recueillir les ovocytes, lavez-les à HCZB et la plaque eux dans KSOM-AA gouttes. </li></ol></li><li> Énucléation de l'ovocyte <ol><li> Utilisez le couvercle d'une boîte de Pétri pour préparer la plaque TNCS. Mettre en place le microscope, et le micromanipulateur. </li><li> Lavez l'aiguille énucléation (7 pm) en PVP avant de commencer avec une énucléation. </li><li> Pour l'énucléation, place un groupe d'ovocytes (10-30) dans une goutte d'HZCB par la cytochalasine B (5 pg / ml). Alors que l'incubation (min. 5 min) gamme des ovocytes horizontalement. </li><li> Prendre un ovocyte et le placer en face de l'aiguille de maintien. Fixer l'ovocyte à l'aiguille tenant en appliquant un vide. Utilisation de l'aiguille énucléation, tournez l'ovocyte jusqu'à la broche-chromosome complexes (SCC, souvent appelé le «noyau») est en position 03 heures. </li><li> Utilisant des dispositifs piézo-impulsions pénétrer la zone pellucide soin, sans endommager l'ovocyte. Placez l'ouverture de l'aiguille adjacente à la broche métaphase II et appliquer le vide. Le "noyau" devrait se déplacer lentement dans l'aiguille, et la membrane doit se joint une fois qu'il est complètement supprimé. </li><li> Transférer les ovocytes énucléés de nouveau dans les gouttes KSOM-AA, et lavez-les plusieurs fois. Répétez l'eétapes de nucléation avec un nouveau groupe d'ovocytes. Continuez jusqu'à ce que tous les oeufs sont énucléés, ou jusqu'à 11 heures environ. </li></ol></li><li> Transfert nucléaire <ol><li> Pour le transfert nucléaire, l'échange de l'aiguille d'énucléation (7 um) avec une aiguille de transfert nucléaire (4 ou 5 um) et le laver avec de PVP. </li><li> Placez vos cellules d'intérêt (par exemple cellules T CD8 +) dans une goutte avec PVP, bien mélanger et laisser incuber pendant une période minimale de 10 min. </li><li> Placer un groupe d'ovocytes énucléés (10-30) dans une goutte d'HCZB par la cytochalasine B (2,5 pg / mL). Alors que l'incubation (min. 5 min) gamme ovocytes horizontalement en utilisant l'aiguille de transfert nucléaire. </li><li> Ramassez une cellule donneuse de la suspension de PVP-cellulaire et l'aspirer au-and-out jusqu'à ce que la membrane externe est en panne (des fragments de la membrane et le cytosol doit être visible). Si nécessaire, un piézo-impulsions peuvent être appliqués. Une fois un noyau a été isolé, déplacez-le un peu dans l'aiguille, et de continuer à ramasser des noyaux jusqu'à ce que vous avez 10-30. </li><li> Déplacer vers la goutte contenant les ovocytes énucléés alignés. Fixer un ovocyte à l'aiguille tenant en appliquant un vide. Placez l'aiguille de transfert nucléaire (les noyaux doivent être éloignées de l'ouverture) adjacent à la zone pellucide et appliquer piézo-impulsions jusqu'à ce que l'aiguille a traversé la zone pellucide. Soigneusement passer un noyau à la pointe de l'aiguille, enfoncer l'aiguille dans l'ovocyte jusqu'à la pointe de l'aiguille est de 2 / 3 à l'intérieur. Appliquez une petite pression négative, de sorte que d'un peu de la membrane ovocytaire est dans l'aiguille. </li><li> La prochaine étape est très critique, car c'est le seul moment où l'ovocyte est réellement «ouvert». Appliquer une seule impulsion de piézo, poussez le noyau de l'aiguille en appliquant une pression positive, soigneusement retirer l'aiguille pour que la pointe est d'environ 1 / 3 dans l'ovocyte, puis appliquer une pression négative et de continuer à reculer l'aiguille joint l'ovocyte. Répétez cette étape avec chaque ovocyte. </li><li> Après tout ovocytes d'un groupe ont reçu un noyau, elles sont lavées et cultivées dans KSOM-AA médias. Répétez cette procédure avec tous les ovocytes. </li><li> Après le dernier groupe a été cultures dans KSOM-AA pour un minimum de 30 min, le SCNT-embryons sont transférés dans des gouttes d'activation des médias Ca libre contenant SrCl2. </li><li> Après 6 heures d'activation, le montant de la pseudo-pronuclei (PPN)-positifs TNCS embryons est déterminé. Les embryons sont ensuite lavées et cultivées dans KSOM-AA gouttes pour 3,5 jours supplémentaires jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de blastocyste. </li><li> Les médicaments ou les produits chimiques de choix (comme trichostatine A) peut être ajouté à l'activation et les milieux de culture. </li></ol></li></ol> 3.Derivation des cellules souches embryonnaires Les blastocystes TNCS peut être utilisé soit pour les transférer dans des pseudo-gravides (aussi connu comme le clonage direct ou en une seule étape) ou de dériver des cellules souches embryonnaires (également connu comme le clonage indirect ou deux étapes). Comme il est beaucoup plus efficace pour générer des cellules ES, nous choisissons la procédure en deux étapes. Dans le cas où le chercheur est intéressé par clonage direct, les blastocystes peuvent être transférées directement dans la pseudo-gravides comme décrit dans la section 5. Il ya de nombreux protocoles décrivant la dérivation de cellules souches embryonnaires. Celle décrite ici est une technique standard, qui utilise des cellules nourricières et de sérum de veau foetal. <ol><li> Le deuxième jour après le transfert nucléaire, préparer une plaque de 96-U-même pour la dérivation de cellules souches embryonnaires. </li><li> Ajouter 100 uL de gélatine dans chaque puits d'une plaque 96-U-même, incuber pendant un minimum de 10 min, et ensuite il supprime. </li><li> Cellules nourricières Décongeler et remettre en suspension dans un volume en fonction du milieu de l'EDD, par exemple des cellules nourricières équivalent à une surface de 25 cm 2 sont remis en suspension dans 10 ml de milieu ESD et 200 pi de la suspension cellulaire sont ajoutés dans chacun des gélatine bien traités. </li><li> Mettez la plaque dans un incubateur et la culture à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Après 3,5 jours, les embryons doivent être au stade de blastocyste. </li><li> Préparer un plat stériles bactérienne en plaquant un médium quelques gouttes de cellules ES et thyrode acide. </li><li> Les blastocystes sont d'abord transférés de la chute KSOM-AA en gouttes contenant normales moyennes de cellules ES et lavées deux fois. </li><li> Soigneusement le transfert d'un groupe de blastocystes (blastocystes 5-10) en une seule goutte d'acide thyrode et gardez là jusqu'à ce que la zone pellucide a dissous. </li><li> Les blastocystes sont ensuite transférés dans une goutte de moyenne ES, lavées deux fois, puis placé dans le chargeur de revêtement 96-U-même la plaque (un blastocyste dans un puits). </li><li> Les embryons sont ensuite cultivés pendant 5-7 jours dans un incubateur à 37 ° C CO, 5% 2 sans les déranger. Cela donne le temps d'embryon à unttach à la couche d'alimentation, et de former une excroissance. </li><li> Préparer des plaques 24 puits, en placage de mangeoires dans le milieu de l'EDD dans chaque puits, par exemple resuspendre l'équivalent de 50 cm 2 de desserte dans 12 ml moyennes EDD, et ajouter 500 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits. </li><li> Retirer délicatement le support de la plaque ESD 96-U-bien avec les embryons, laver chaque puits deux fois avec 250 uL Hepes (ou PBS), ajouter 50 uL trypsine et incuber pendant environ 5 min à 37 ° C. </li><li> Pipette de haut en bas plusieurs fois, jusqu'à ce que l'excroissance s'est effondré en une suspension à cellule unique, le transfert dans une plaque de 24 puits et incuber à 37 ° C CO, 5% 2. </li><li> Si la dérivation CES a réussi, les colonies ESC doit être visible après 7-10 jours. </li></ol> D'injection 4.Blastocyst L'injection de blastocystes est une technique de routine pour générer n'importe quel type de modèle de souris transgénique. Il est important de mentionner que l'injection de blastocystes et le transfert subséquent en pseudo-gravides doit être chronométré bien. <ol><li> Premier souris femelles avec PMS et HCG comme décrit dans la section 2.1. Après l'injection de HCG mis les souris femelles avec des souris mâles (une femelle et un mâle de souris par cage). </li><li> Le lendemain, vérifiez les femelles pour les bouchons. Ceci est compté comme 0.5dpc (jours après le coït). </li><li> Embryons fécondés sont ensuite isolés de l'oviducte comme décrit dans la section 2.1, et cultivées dans KSOM-AA pour trois jours supplémentaires. </li><li> Préparer les cellules ES sur le jour de l'injection blastocyste (3.5dpc). </li><li> Retirer moyennes à partir des cellules ES, laver deux fois avec HEPES (ou PBS), ajouter la trypsine et incuber pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules trypsinisées à moyen ES, plaque dans un plat, et incuber pendant 45-60 min à 37 ° C, 5% de CO 2 pour réduire la quantité de cellules nourricières (cellules nourricières adhèrent plus rapidement que les cellules ES). </li><li> Transférer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube et centrifuger pendant 5 min à 1000rpm. </li><li> Retirer le surnageant, la cellule Resuspendre le culot dans 500 uL moyennes ES et de stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire. </li><li> Préparer le couvercle d'une boîte stérile bactérienne par des gouttes plaquage contenant PVP et HCZB. </li><li> Préparer une aiguille 15 um en chargeant avec le mercure, le plaçant en position et le laver avec de la PVP. </li><li> Placer un groupe de blastocystes (10-30 blastocystes) dans une goutte avec HCZB, et ajouter 50 à 50 uL de suspension de cellules ES (dépend de la concentration) dans une autre goutte de HCZB. </li><li> Ramassez les cellules ES (50-100 cellules) avec l'aiguille d'injection. </li><li> Déplacer à la baisse avec les blastocystes. Alignez les blastocystes horizontalement, et de fixer un avec l'aiguille tenant en appliquant un vide. </li><li> Utilisation de l'aiguille d'injection tourner le blastocyste jusqu'à ce que la masse cellulaire interne (ICM) est à la position 09 heures. </li><li> Placez votre aiguille d'injection à 03 heures, assurez-vous qu'il n'ya pas de cellules ES à la pointe de l'aiguille, et d'appliquer piézo-impulsions jusqu'à ce que l'aiguille d'injection pénètre à travers la zone pellucide et le trophectoderme dans le blastocèle. </li><li> Libérer une cellules ES quelques (5-15 cellules), de sorte que les cellules ES coller à l'ICM. Continuez jusqu'à ce que tous les blastocystes d'un groupe ont été injectées avec des cellules ES. </li><li> Après un groupe de blastocystes est terminée, les laver deux fois dans KSOM-AA et gardez-les dans une goutte avec KSOM-AA jusqu'à ce que tous les blastocystes sont injectés. </li></ol> 5. Transfert d'embryons Le transfert des embryons dans les pseudo-gravides représente une intervention chirurgicale, qui doit être effectué très soigneusement et selon les directives de l'institut du chercheur. <ol><li> Anesthésier souris receveuses femelles, se raser quadrant inférieur droit, et à désinfecter. </li><li> Utiliser des ciseaux ouvrir la peau, et séparé du péritoine de la peau. </li><li> Localisez l'ovaire à travers le péritoine (tache rouge), et d'ouvrir le péritoine à proximité de l'ovaire. </li><li> En utilisant une pince, soigneusement attraper l'oviducte et sortir de l'utérus. </li><li> Procurez-vous un groupe d'environ 10 blastocystes avec un capillaire relié à une pipette bouche. </li><li> Fixer l'utérus avec une pince, faites un tout petit en elle avec une petite aiguille, et insérez le capillaire avec des blastocystes dans le lumen de l'utérus. </li><li> Soigneusement libérer les embryons dans l'utérus, et supprimer vos capillaire. </li><li> Poussez l'utérus dans la cavité abdominale. </li><li> Repérez les bords du péritoine et de le fermer avec quelques points de suture. </li><li> Fermer la peau de la souris avec un peu d'agrafes. </li><li> Pour douleur post-opératoire, administrer 5 mg carprofène par mg de poids corporel. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Noyaux de cellules somatiquestransfert de lymphocytes T pré-défini dans B6CF1 fond. Les chiffres absolus et relatifs des embryons générés à partir des cellules CD8 + T et les cellules souches embryonnaires dérivées de blastocystes TNCS. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Analyse des flux Représentant cytométrie de souris chimériques injecté avec TNCS cellules souches embryonnaires. Porte et le nombre (au total pour cent par les lymphocytes T CD8 +) indique la présence de certaines cellules CD8 + T chez les souris chimériques.

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

Nous avons montré ici que SCNT peut être utilisée pour générer des souris Transnuclear partir des cellules T avec des pré-défini la spécificité. Bien que non représenté ici, la technique devrait également être utilisable pour générer des souris Transnuclear partir de cellules B avec pré-défini la spécificité. Une chose importante à considérer est la souche et le sexe des souris, qui est infecté ou immunisé et utilisée pour isoler des cellules T ou B de l&#39;intérêt. Comme les cellules T et B ont un rendement très faible reprogrammation en général, nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;hybrides F1 haplotype désiré. Parce que la cellule donneuse détermine aussi le sexe, nous recommandons l&#39;utilisation T ou les cellules B de souris mâles. Cela signifie que seuls mâles souris chimériques transmettrait le TCR ou BCR travers la lignée germinale, avec les souris mâles étant plus facile et plus rapide pour se reproduire. Pris ensemble, nous pensons que la reprogrammation épigénétique par TNCS représente un outil puissant pour générer un nouveau type de modèles de souris, qui sera un grand avantage pour le domaine de l&#39;immunologie.

<table><tbody><tr><td>Lyseur d'érythrocytes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Filtre pour cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de jument pleine (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotrophine chorionique humaine (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Type IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>Milieu personnalisé</td></tr><tr><td>Milieu sans Ca pour activation</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>Milieu personnalisé</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100 mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>Préparer une solution à 10 % dans HCZB, puis ajouter 0,1 % d'AlbuMAX I</td></tr><tr><td>Cytochalasine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>Trichostatine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5 mM = 1000x</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de maintien</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles d'injection et de transfert</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipette buccale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Applicateur de clips chirurgicaux</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Clips chirurgicaux</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15 %</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200 mM = 100x</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>5&amp;#x03BC;l dans 500 ml</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>Inhibiteur de MEK</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9900L</td><td>Pour la dérivation de cellules ES uniquement, ajouter au milieu ES (concentration finale 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

souris transnuclear avec des spécificités t pré-définis cell receptor contre toxoplasma gondii obtenues par tncs

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Les lymphocytes, comme les cellules T, subir génétique V (D) J, pour générer un récepteur avec une certaine spécificité 1. Souris transgéniques pour un antigène spécifique réarrangés récepteur des cellules T (TCR) ont été un outil indispensable pour étudier le développement des cellules T et leur fonction. Toutefois, ces TCR sont généralement isolées à partir des cellules T après pertinente à long terme de la culture souvent après stimulation antigénique répétée, qui sélectionne inévitablement des cellules T avec une haute affinité. Aléatoire intégration génomique du TCR α-β et de la chaîne et l&#39;expression du non-endogènes promoteurs peuvent conduire à des variations dans le niveau d&#39;expression et de la cinétique. Reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire de cellule somatique offre un outil pour générer des cellules souches embryonnaires et les souris d&#39;une cellule d&#39;intérêt. Par conséquent, lorsque TNCS est appliquée aux cellules T de spécificité connue, ces génétiques V (D) J réarrangements sont transférés à des cellules souches embryonnaires SCNT (CES) et les souris qui en sont dérivés, tandis que les marques épigénétiques sont réinitialisés. Nous avons démontré que les cellules T avec pré-défini les spécificités contre Toxoplasma gondii peut être utilisé pour générer des modèles de souris qui expriment la TCR spécifique de leur locus endogène, sans modification génétique introduite expérimentalement. La relative facilité et la rapidité avec laquelle ces modèles peuvent être obtenus Transnuclear est prometteuse pour la construction de modèles d&#39;autres maladies.

Nous démontrons ici que la reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) peut être utilisé comme un outil pour générer des modèles de souris avec des pré-définis récepteur des cellules T (TCR) des spécificités. Ces souris Transnuclear exprimer la correspondante du TCR de leur locus endogène, sous le contrôle du promoteur endogène.

Souris Transnuclear avec des spécificités T pré-définis Cell Receptor contre Toxoplasma gondii Obtenues par TNCS

Les lymphocytes, tels que les cellules T, subissent une recombinaison génétique V(D)J afin de générer un récepteur présentant une spécificité donnée1. Des souris transgéniques pour un agencement...

Les souris transgéniques pour des récepteurs spécifiques d'antigènes des lymphocytes T ont été indispensables à l'étude du développement et de la fonction des lymphocytes T afin de générer des modèles murins dotés de spécificités prédéfinies de récepteurs des lymphocytes T par transfert nucléaire de cellules somatiques ou transfert nucléaire somatique (SCNT). Une souris est infectée par un agent pathogène d'intérêt. Les lymphocytes T sont isolés à partir de la souris, puis purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence.Les lymphocytes T purifiés sont ensuite utilisés pour le transfert nucléaire de cellules somatiques. Une fois que les embryons atteignent le stade de blastocyste, les cellules souches embryonnaires sont isolées. Ces cellules sont ensuite injectées dans des blastocystes, qui sont par la suite transférés à des souris pseudo-gestantes.Les souriceaux résultants expriment une augmentation marquée de la population de lymphocytes T d'intérêt, ce qui peut être validé par une analyse PAX. Bonjour, je m'appelle Okta AK et je suis post-doctorant ici à l'Institut White pour la recherche biomédicale. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment réaliser des injections somatiques assistées par transfert CLE et des transferts embryonnaires.L'avantage principal du transfert somatique est que l'on peut générer des modèles murins exprimant leur récepteur des lymphocytes T à partir du locus endogène, et donc sous le contrôle du promoteur endogène, et que ces modèles murins peuvent être générés très rapidement. Le transfert liquide somatique peut être utilisé comme outil pour produire des modèles murins dotés de spécificités prédéfinies de récepteur des lymphocytes T ou de récepteur des lymphocytes B. Ceci présente un intérêt particulier pour les chercheurs travaillant dans des domaines tels que l'auto-immunité, les maladies infectieuses et le cancer.Pour isoler des lymphocytes T spécifiques d'un agent pathogène tel que Toxoplasma gondii, les souris infectées sont euthanasiées par injection intrapéritonéale au pic de la réponse immunitaire, la rate est ensuite prélevée de la souris euthanasiée et les cellules donneuses sont homogénéisées, isolées, puis incubées avec des anticorps marqués par fluorescence et le tétramère approprié. Enfin, un tri par cytométrie en flux est effectué afin d'obtenir les lymphocytes T spécifiques du pathogène. La veille de la procédure d'énucléation de l'ovocyte.Préparez des capillaires d'injection piso de quatre, cinq et sept micromètres en utilisant une seringue pour les charger rétrogradement avec du mercure. Le lendemain, commencez le protocole de transfert nucléaire de cellule somatique en collectant les ovocytes, puis, à l’aide d’une pipette buccale, transférez-les dans des gouttelettes de milieu K-S-O-M-A-A dans une boîte de Pétri. Dans le couvercle de la boîte de Pétri.Préparez un aate pour effectuer le transfert nucléaire de cellules somatiques ou SCNT en plaçant environ 10 gouttes de PVP. Environ 10 gouttes de HCZB contenant cinq microgrammes par millilitre de cyto B et environ 10 gouttes de HCCB contenant 2,5 microgrammes par millilitre de cyto B. Cette plaque sera appelée la plaque S-C-N-T-A. Placez la plaque S-C-N-T-A sur la platine d'un microscope composé inversé.Placez ensuite une aiguille d'énucleation de sept micromètres dans le micromanipulateur et rincez-la en aspirant cinq à dix fois une solution de PVP à jeter. Transférez ensuite 10 à 30 cytes bloqués en métaphase II depuis la boîte de Pétri vers l'une des gouttes de HCCB contenant cinq microgrammes par millilitre de Cyto B, sur la plaque S-C-N-T-A. Incubez pendant cinq minutes à température ambiante ; durant l'incubation, alignez les ovocytes horizontalement.Une fois cinq minutes écoulées, utilisez l'aiguille d'énucleation pour placer un ovocyte devant l'aiguille de maintien. À l'aide d'un micro-injecteur, appliquez un vide pour fixer l'ovocyte à l'aiguille de pipette micrométrique de maintien.Ensuite, à l’aide de l’aiguille d’énucleation, faites pivoter l’ovocyte jusqu’à ce que le complexe du fuseau chromosomique, qui apparaît comme étant très transparent par rapport au cytoplasme opaque, soit à la position de trois heures. Déclenchez une impulsion piézo en appuyant sur la pédale afin de pénétrer la zone pellucide. Une impulsion piézo est une impulsion mécanique qui se propage longitudinalement et fait vibrer l’extrémité de l’aiguille d’énucleation. Les vibrations de l’extrémité facilitent le perçage de la zone pellucide.Une fois traversée la zone palitale, placez l'ouverture de l'aiguille de nucléation adjacente au fuseau de métaphase II et appliquez le vide. Le complexe chromosomique du fuseau entrera lentement dans l'aiguille. Une fois l'aiguille retirée, la membrane doit se refermer d'elle-même.Enfin, à l’aide d’une pipette buccale, transférez les cytes énucléés dans les gouttes de K-S-O-M-A-A. Ensuite, à l’aide de la même pipette, lavez-les en les transférant de goutte en goutte de KSOM AA. Pour effectuer le transfert nucléaire, remplacez l’aiguille d’énucléation de sept micromètres sur le micromanipulateur par une aiguille de transfert nucléaire de quatre à cinq micromètres. Lavez l’aiguille avec du PVP comme précédemment.Placer les lymphocytes T CD8 positifs isolés précédemment dans une goutte de PVP sur la plaque S-C-N-D-A. Bien mélanger et incuber au moins 10 minutes à température ambiante. Ensuite, transférer de 10 à 30 cellules NUCLÉÉES dans une goutte de HCZB contenant 2,5 microgrammes par millilitre.Incuber Cyto B sur la lame de S ct. A pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant l'incubation, utiliser l'aiguille de transfert nucléaire pour aligner horizontalement les cytes à l'aide de l'aiguille d'injection.Prélevez une cellule donneuse CD8 positive dans le milieu PVP et aspirez-la plusieurs fois jusqu'à ce que la membrane externe se soit rompue. Si nécessaire, appliquez une impulsion piézo : des fragments de membrane et de cytosol doivent être visibles. Aspirez ensuite le noyau dans l'aiguille.Ensuite, continuez à prélever des noyaux jusqu'à ce qu'il y en ait de 10 à 30. Puis, déplacez-vous vers la goutte contenant les cytes énucléés alignés. Appliquez le vide pour fixer un ovocyte à l'aiguille de maintien.Ensuite, placer l'aiguille de transfert nucléaire NU à côté de la zop lucita, les noyaux étant orientés à l'opposé de l'ouverture. Appliquer une impulsion piézoélectrique jusqu'à ce que l'aiguille traverse la zop lucita. Pousser le micromanipulateur pour déplacer délicatement un noyau jusqu'à l'extrémité de l'aiguille.Introduire l'aiguille dans l'ovocyte jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille soit insérée aux deux tiers de sa longueur. Appliquer une légère pression négative afin qu'une petite partie de la membrane de l'ovocyte pénètre dans l'aiguille. L'étape suivante est très critique.Étant donné que c'est le seul moment où l'ovocyte est réellement ouvert, appliquez une seule impulsion ZO. Ensuite, appliquez une pression positive pour expulser le noyau hors de l'aiguille.Retirez soigneusement l'aiguille afin que la pointe se trouve à environ un tiers à l'intérieur de l'ovocyte, puis appliquez une pression négative et continuez à retirer l'aiguille. Pour sceller l'ovocyte. Répétez cette étape pour chaque ovocyte.Une fois que tous les ovocytes ont reçu un noyau, transférez-les dans la boîte de Pétri et lavez-les en les déplaçant de goutte en goutte de milieu KS OM AA, puis incubez-les à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Après l'incubation, transférez les embryons SCN T dans des gouttes de milieu d'activation sans calcium contenant du chlorure de strontium. Le chlorure de strontium active l'ovocyte en induisant des oscillations calciques similaires à celles qui se produisent lors de la fécondation.Incuber pendant six heures. Si désiré, AJOUTER du TSA, qui est un inhibiteur non spécifique des histones diacétylases, dans le milieu d'activation afin d'améliorer l'efficacité après l'activation. Examiner les embryons au microscope inversé pour déterminer la quantité de pseudo-pronoyaux ou d'embryons SCNT positifs pour les PPN. Les PPN peuvent être identifiés en fonction de leur apparence.Ils ressemblent à des œufs. Les rincer et mettre en culture côté jaune vers le haut. Les embryons et les gouttes de K-S-O-M-A-A sont incubés pendant trois jours et demi à 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de blastocyste.Au départ, vous devez vous concentrer sur l'exécution correcte des procédures que nous venons de vous montrer pour la nucléation et le transfert nucléaire NU. Une fois que vous maîtriserez ces techniques, les procédures suivantes seront plus faciles à réaliser. Les cellules souches embryonnaires, ou cellules ES, utilisées ici ont été obtenues à l'aide de techniques standard.Elles doivent être préparées le jour de l'injection assistée par souffle, trois jours et demi après le coït. Préparez le couvercle d'une boîte bactériologique stérile en déposant des gouttes contenant du PVP et du HCZP. Préparez ensuite une pipette d'injection de 15 micromètres pour l'impulsion piso comme précédemment.Ensuite, placez l'aiguille d'injection dans le micromanipulateur et rincez-la avec du transfert PVP. Effectuez 10 à 30 impulsions de blast dans une goutte de HCZB. Puis, déposez cinq à cinquante microlitres de la suspension ESL dans une autre goutte de HCZB.Il devrait y avoir suffisamment de cellules ES pour qu'elles puissent être facilement prélevées, mais sans être trop nombreuses. Ensuite, prélevez 30 à 100 cellules ES à l’aide de l’aiguille d’injection. Déplacez-vous vers la goutte contenant l’embryon auxiliaire.Aligner horizontalement l'assistance au blast et fixer celle-ci à l'aide de l'aiguille de maintien en appliquant un vide. Utiliser l'aiguille d'injection pour tourner l'assistance au blast jusqu'à ce que la masse cellulaire interne soit à neuf heures. Placer l'aiguille d'injection à trois heures.Veillez à ce qu'il n'y ait aucune cellule ES à l'extrémité de l'aiguille, puis appliquez une impulsion piso jusqu'à ce que l'aiguille d'injection traverse la zop lucita et la trifecta pour pénétrer dans le blastique scellé. Libérez cinq à quinze cellules ES afin qu'elles s'attachent à la masse cellulaire interne. Poursuivez jusqu'à ce que tous les blastoïdes auxiliaires aient été injectés, une fois les injections terminées.Laver deux fois dans du K-S-O-M-A-A et procéder au transfert chirurgical des embryons dans des femelles pseudo-gestantes. Placer une souris femelle receveuse pseudo-gestante sous anesthésie dans la zone chirurgicale. À l’aide d’un rasoir électrique, raser les poils du quadrant inférieur droit. Désinfecter la zone à l’aide d’une solution à base d’iode et d’éthanol à 70 % sous un microscope stéréoscopique.Utilisez des ciseaux pour ouvrir la peau, puis placez les ciseaux fermés entre la peau et le péritoine et ouvrez-les pour séparer le péritoine de la peau. Localisez l'ovaire à travers le péritoine, qui doit apparaître comme une tache rouge. Ensuite, utilisez les ciseaux pour ouvrir le péritoine dans cette région.Utilisez une pince pour saisir délicatement le CTU ou la graisse environnante et retirez l'utérus à l’aide d’une capillaire reliée à une pipette buccale. Prélevez un groupe d’environ 10 blastocystes en tenant l’oviducte et l’utérus avec la pince. Utilisez une aiguille pour percer un petit trou dans l’utérus.Insérez ensuite la capillarité avec l'assistance de soufflage dans la lumière de l'utérus et libérez-les. Repoussez l'utérus dans la cavité abdominale. Repérez les bords du péritoine et fermez-le par quelques points de suture.Fermer la peau de la souris à l’aide de quelques agrafes. Administrer un médicament analgésique par voie sous-cutanée. Puis transférer la souris dans sa cage sous une lampe chauffante.Surveiller la respiration de la souris jusqu'à ce qu'elle se réveille. Après l'énucléation et le transfert nucléaire de cellules somatiques. Environ 70 % des embryons étaient positifs pour les pseudo-pronoyaux.Comme le montre cette figure, le traitement avec le TSA pendant six ou dix heures n'a eu aucun effet. Après trois jours et demi de culture, cinq à dix pour cent des embryons se sont développés en blastocystes.Encore une fois, l'ajout de TSA n'a eu aucun effet sur le taux de développement des blastocystes de soutien. Les blastocystes de soutien issus de transfert nucléaire somatique ont ensuite été utilisés pour obtenir des cellules souches embryonnaires. Le TSA a significativement amélioré le taux d'obtention des LSE à partir des blastocystes de soutien.Les cellules S-C-N-T-E-S sont utilisées pour générer des souris chimériques. Du sang est prélevé sur ces souris et analysé afin de détecter la présence de lymphocytes T spécifiques par cytométrie en flux, comme illustré ici. Lorsque le sang est marqué par un anticorps anti-CD8 et un tétramère spécifique, une population double positive peut être identifiée.Indiquant que la cellule donneuse utilisée pour le transfert nucléaire d'une cellule somatique était de la spécificité correcte. Je viens de vous montrer comment réaliser le transfert de cellules somatiques, les injections assistées par blastocyste et le transfert d'embryons. Le point le plus important à prendre en compte est la pureté de vos cellules T ou de vos cellules B.Une fois que vous aurez appris à réaliser le transfert somatique et que vos embryons seront au stade de blastocyste, vous pourrez choisir entre les transférer directement dans des femelles pseudo-gestantes ou les utiliser pour établir des cellules souches embryonnaires et générer des souris chimériques.

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