Name: Imagerie verticale de Drosophila Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Découvrez un protocole de montage vertical pour embryons de Drosophila utilisant la microscopie confocale. Cette méthode permet de mesurer précisément la taille des embryons et de quantifier l'expression des protéines et de l'ARN.

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Les auteurs sont particulièrement reconnaissants à Deborah Harris et Danielle MacKay. Prise en charge de ce travail a été fourni par le ministère de la biologie et de l&#39;Ordre des Arts et des Sciences de CWRU, et par HHMI subvention nombre 52005866 faveur de l&#39;éducation de premier cycle en sciences biologiques.

1. Méthodologie d'imagerie <ol><li> Faire fondre la gelée de glycérine dans un bain d'eau à 55 ° C degrés pendant 20-30 minutes jusqu'à ce qu'elle devienne un liquide homogène. Swirl, mais ne secouez pas la bouteille pour éviter la formation de bulles. </li><li> Alors que la gelée fond, appliquer une fine couche de glycérol à l'aide d'un Kimwipe sur une lame de verre propre (en option). </li><li> Pipette de 1 à 1,5 ml de glycérine fondue gelée à l'aide d'une pointe de pipette P1000 coupe sur la surface de la diapositive pour créer une première couche mince. Pipeter avec précaution pour éviter les bulles. </li><li> Laissez la gelée de solidifier pendant 5 min sur une surface horizontale, puis placer la lame à -20 ° C pendant 5 min et procéder à l'alignement embryon. Alternativement, couvrir la lame avec le Saran Wrap et le placer à 4 ° C pendant 5 jours. </li><li> Introduire à la pipette une petite goutte d'embryons colorés dans du glycérol 70% / PBS ou autres Antifade glycérol à base de milieu de montage (par exemple Slowfade ou Vectashield) sur le côté de la litière gelée. </li><li> Commencez pré-alignement des embryons parindividuellement les transférer à partir du menu à la surface gelée. Transférez-les à l'aide d'une aiguille hypodermique inclinée, en utilisant le côté incliné comme une cuillère. </li><li> Environ placer les embryons ainsi que 2 à 3 colonnes. Si un embryon se coince dans l'aiguille, remuer dans la liste déroulante contenant les embryons d'autres pour le libérer. Ne perdez pas de temps avec soin en les alignant à ce stade. Laissez de l'espace entre les colonnes. </li><li> Aligner les embryons en les faisant glisser horizontalement sur le support gelée à l'aide de l'aiguille hypodermique. Tout en faisant glisser, orienter les têtes et les queues dans la même direction. Rendre parallèles les uns aux autres le long de la colonne. Enlever l'excès de glycérol PBS laissé comme une traînée avec un morceau de Kimiwipe torsadée. Remarque: le glycérol en excès entraîne des embryons pour être lâchement enfermée à l'intérieur du gel, ce qui entraîne la séparation des couches de gelée deux, ce qui rend difficile à découper et à monter. En revanche, la suppression de glycérol trop de sécher et aplatir embryons. </li><li> Utiliser un embout de coupe jaune pour diffuserune fine couche de gelée sur les embryons (50-150 ul, selon la façon dont beaucoup ont été alignés). </li><li> Placer la lame dans congélateur à -20 ° C pendant 10-20 min ou le stocker à 4 ° C pendant la nuit. Assurez-vous que la gelée est complètement rigide avant de couper. Sinon, le bloc d'embryons sera très difficile à exciser. Les meilleurs résultats sont obtenus pour la coupe le lendemain. </li><li> Sous un microscope à dissection, utiliser une lame de rasoir pour couper complètement à travers la gelée sur les deux côtés des embryons alignés. Maintenez la lame de rasoir à un angle de 90 ° pour réaliser des coupes droites. Les coupes doivent être faites très près des pôles antérieur et postérieur de l'embryon pour éviter les excès de gelée qui peuvent entraver l'imagerie. </li><li> Ajouter 100-200 ul de froid PBT (4 ° C, PBS + 0,1% Tween 20) à côté des coupes et soigneusement gratter la gelée entre les embryons à l'aide d'une spatule. Remarque: Le détergent en PBT permet l'élimination de la gelée de la glissière sans endommager les embryons. </li><li> L'utilisation d'un e aiguille, transferte bloc de gelée avec des embryons intégrés à une lame propre pour couper davantage. Couper les petits blocs avec des embryons 5-7. Utilisez PBT de se déplacer facilement autour du bloc de gelée. Sinon, placez le bloc sur une surface de verre sec pour laisser fixent sur le verre, ce qui crée plus de stabilité pour justement couper la gelée, le cas échéant. </li><li> Retourner verticalement les embryons noyées dans la gelée à l'aide d'une lame de rasoir et une aiguille. Pour la visualisation au microscope, soit procéder à une des deux étapes ci-dessous, en fonction du type de Pied pour microscope utilisé. </li><li> Microscope inversé: fini les blocs d'embryons lieu sur une lamelle de long, avec des embryons dans une position verticale. Faire en sorte que le côté de l'embryon avec le moins de gelée sera en contact plus étroit avec l'objectif. </li><li> Microscope droit: faire deux piles de quatre lamelles collées # 1 avec de la superglue pour être utilisé comme "supports" et placez le bloc d'embryons dans du glycérol entre les «supports». Combler les piles à l'aide d'unlamelle longue. </li><li> Pour l'analyse confocale, vérifiez la distance de travail des objectifs à utiliser pour savoir si vous pouvez l'image tout au long de l'embryon ou seulement partiellement. Par exemple, D. embryons ont melanogaster ~ 0,55 mm de longueur et peut être entièrement imagé en utilisant un Zeiss 20x plan-Apo ou un 40x LD Neo-Fluor objectif. Le site suivant contient des informations sur les objectifs Zeiss disponibles et vous donne la possibilité aux objectifs de recherche en fonction de distances de travail: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Les résultats représentatifs Parce que les embryons sont laissés intacts, cette méthode peut être utilisée pour effectuer des mesures précises de la taille des embryons et les distances entre les profils d'expression génique. Dans la figure 1, nous montrons une embryons au stade blastoderme colorées avec du DAPI tache nucléaire (bleu), la protéine anti-dorsale (rouge), l'ARNm sog (jaune) et l'ARNm sna (vert). Proces morphologiques session, comme l'invagination du mésoderme (Figure 2A, B) et la migration des cellules mésodermiques (figure 3 et 4) peuvent également être visualisés à l'aide de cette méthode. Différentes positions Z le long de l'axe DV peut être obtenue en modifiant le plan focal, comme représenté sur les figures 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Upright tranche optique d'un embryon intact au stade blastoderme. Double coloration pour l'ARNm et de protéines. ARNm cibles pour sondes in situ (sog et sna) et colorées par la protéine anticorps primaire (anti-dorsale) sont indiqués sur la figure. DAPI est utilisé pour marquer les noyaux. Notez que l'expression de sog et sna sont situés dans le cytoplasme apical, alors que l'expression de la dorsale est d'origine nucléaire. Des signaux forts de transcriptions SOG naissantes qui sont situés dans les noyaux peuvent aussi être vus à ce grossissement. 2175fig2.jpg "alt =" Figure 2 "/&gt; Figure 2. Imagerie verticale d'une sonde d'ARNm intacts gastrulating embryon. Utilisés et leurs couleurs respectives sont indiquées sur la figure. A) A noter que dans cette étape, trois gènes colorées avec la même fluor (sna, sog et dpp, en vert), sont exprimés dans des domaines séparés dans l'espace. Le mésoderme invagination exprime sna, la couche de neuroblastes exprime salle et l'ectoderme exprime dpp, tandis que l'expression sog est toujours présente dans les régions ventrales du système nerveux. B) Dans un plan plus profond confocale de l'embryon même, nous notons la base du mésoderme invagination exprime fortement sna, mais sa région apicale exprime des niveaux inférieurs. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Imagerie verticale d'un embryon intact avec bande germe étendu sog ARN (jaune);. Escargot, salle et dpp (ind et sna). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Imagerie verticale d'un embryon intact pendant extension de bande germe sog ARN (jaune);. Escargot, salle ARNm et DPP (vert), la protéine dorsale (rouge). A) Notez les neuroblastes délamination de l'épithélium (flèche), teinté à la fois pour salle et sna à ce stade (vert). On notera également l'expression restreinte de SOG à la ligne médiane ventrale (jaune). L'expression de dpp à ce stade peut être vu sur les côtés latéraux del'embryon (astérisque). B) l'article optique dans l'embryon même représentée en A proximité de l'extrémité de la longueur de l'embryon, qui correspond à la mi-postérieur région. Les cellules sont colorées ligne médiane ventrale pour sog.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

Prendre des images des sections efficaces d&#39;embryons de drosophile peut être difficile, car elle nécessite soit une dissection minutieuse de la main tranches 2 ou l&#39;utilisation de médias intégrés pour le traitement microtome, qui est généralement néfaste pour les colorations fluorescentes. En variante, Z-empilements réalisés dans un microscope confocal permet de faire de la reconstruction 3D de section transversale des images. Cependant, il est temps de faire plusieurs tranches fines confocale pour une reconstruction 3D précise et photoblanchiment devient problématique. Un autre problème lorsque les embryons d&#39;imagerie qui sont montés longitudinalement est la diffusion de la lumière qui se produit lorsqu&#39;il atteint sections plus profondes de l&#39;embryon, ce qui complique également prendre des mesures précises de signaux fluorescents dans le but de quantifier les niveaux d&#39;expression de protéine ou d&#39;ARNm 1. Même avec un microscope à deux photons confocale, diffusion de la lumière est toujours un sujet de préoccupation en raison de l&#39;opacité de la matière jaune dans le milieu de l&#39;embryon, Qui permet la sélection de supports de montage pour une transparence optimale de l&#39;échantillon à être limitée. Pour contourner ces problèmes, une nouvelle technique appelée &quot;End-on&quot; l&#39;imagerie des embryons de positionnement vertical a été récemment mis au point à l&#39;image en direct et des échantillons fixes 4. Dans cet article, nous avons développé un nouveau protocole pour les embryons montés verticalement qui permet une préparation simple et la visualisation des embryons fixes ou des tissus de n&#39;importe quelle taille et la forme sont colorées avec de multiples sondes in situ 3. Notre procédé consiste à utiliser un support de montage avec consistance gélatineuse qui est utilisée pour envelopper embryons alignés à l&#39;intérieur de celui-ci. Couper des blocs de ce support de montage intégrés contenant des embryons peut être placé en position verticale avant l&#39;imagerie dans tout type de microscope confocal. En intégrant les embryons dans la gelée et les positionner à la verticale, nous sommes en mesure de prendre horizontales sections en utilisant la microscopie confocale, dans lequel les cellules along de l&#39;axe dorso-ventral de l&#39;embryon sont présentés simultanément. Il s&#39;agit d&#39;une amélioration significative des fins de quantification, car les problèmes de diffusion de la lumière et de photoblanchiment des colorants fluorescents qui se produit dans conventionnelle Z-stack reconstruction des embryons longitudinalement montés sont désormais éliminés. Ainsi, la quantification de l&#39;expression du gène ou de la teneur en protéines selon l&#39;axe dorso-ventrale est exacte, car les cellules situées à opposées dorsal-ventral positions sont imagés en même temps et à la même confocale Z-position. En outre, la méthode décrite permet d&#39;obtenir une complète 2-D image sur l&#39;axe dorso-ventral de l&#39;embryon 3-D sans utiliser de méthodes complexes de déroulage de calcul pour visualiser les cellules à différentes positions le long de l&#39;axe DV 6. Certaines des étapes essentielles incluent le retrait du glycérol en excès après alignement des embryons, afin d&#39;éviter répartis entre les deux couches de gelée. Toutefois, si l&#39;échantillon est trop déshydraté, le résultatment l&#39;image sera déformée et ont une morphologie incorrecte. En outre, si le milieu de la gelée autour de l&#39;embryon est coupé à un angle plutôt que droite, l&#39;image résultante peut apparaître moins rond et plus en forme ovulaire, en raison d&#39;un mauvais positionnement des embryons à un angle autre que 90 degrés. Enfin, si la gelée n&#39;est pas coupé assez près de l&#39;embryon sur les extrémités antérieure / postérieure, il n&#39;est pas possible d&#39;obtenir une image correcte car la distance de travail de l&#39;objectif serait principalement utilisé pour focaliser dans la gelée et pas l&#39;embryon. Une autre étape importante qui peut être nécessaire lorsque l&#39;imagerie embryon fin gastrulating est de bien trier les stades d&#39;intérêt dans le champ avant de les aligner. Habituellement, les embryons sont mis en scène en fonction des caractéristiques morphologiques qui peuvent être plus facilement reconnus lorsqu&#39;il est en position longitudinale. Parmi les modifications alternatives qui peuvent être faites avec cette méthode est d&#39;inclure un anti-faderéactif (par exemple p-phénylènediamine ou PPD) dans la seconde couche de gelée pour la protection contre le photoblanchiment de colorants fluorescents.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Glycérine Jelly médias montage </td><td></td><td> Electron Microscopy Sciences Société </td><td> 17998-10 </td><td> Contient une faible concentration de phénol comme conservateur et doit être utilisé dans la hotte ou dans un endroit bien ventilé. Recette pour faire vos propres médias est décrite dans Zander, 1997. </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 700 Confocal </td><td></td><td> Zeiss </td><td></td><td> Les objectifs suivants ont été utilisés: Plan-Apo 20x 0,8 M27 (DEO 0.55mm); CE Plan-Neofluar 40x 1,3 huile (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0,6 Korr 40X (WD 2.9mm). </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin à 0,1% De Tween 20 (PBT) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> Lames de microscope </td><td></td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td><tr><td> Lamelles de verre </td><td></td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 72204-02 </td><td> Taille 1 ½ (spécifique pour les objectifs utilisés dans ce travail). </td></tr><tr><td> Lamelles de verre (pour la fabrication des supports) </td><td></td><td> Fisherfinest </td><td> 12-544-10 </td><td> Utilisez quatre lamelles collées avec de la colle. </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td> M5 sauvage Wild Heerbrugg Makroskop </td><td> M420 </td><td></td><tr><td> Lame de rasoir </td><td></td><td></td><td></td><td> Les lames en acier de bord en arrière simples industrielles </td></tr><tr><td> Spatule </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 21-401-10 </td><td></td><tr><td> Aiguilles hypodermiques </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 1482610 </td><td> Calibre 26 </td></tr&gt; <tr><td> Pipettes </td><td></td><td> Labnet </td><td></td><td></td></tbody></table></div>

imagerie verticale de<em&gt; drosophila</em&gt; embryons

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Plusieurs gradients morphogénétiques connus et les mouvements cellulaires se produisent le long de l&#39;axe dorsal / ventral de l&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon. Cependant, les techniques actuelles utilisées pour afficher ces processus sont quelque peu limitées. Le protocole suivant décrit une nouvelle technique pour le montage fixées et marquées<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons à des fins de visualisation coronale avec l&#39;imagerie confocale. Cette méthode consiste à incorporer embryons entre deux couches de supports de montage gelée de glycérine, et bandes de gelée d&#39;imagerie en position verticale. La première étape pour prendre en sandwich les embryons est de faire une litière fine gelée de glycérine sur une diapositive. Ensuite, les embryons sont soigneusement alignées sur cette surface et recouvert d&#39;une seconde couche de gelée. Après la seconde couche est solidifiée, les bandes sont découpées de gelée et déplacé verticalement pour l&#39;imagerie. Alternatives sont décrites pour la visualisation des embryons en fonction du type de microscope reposer à être utilisé. Étant donné que toutes les cellules le long de l&#39;axe dorso-ventrale sont imagés à l&#39;intérieur d&#39;un seul foyer commun Z-plan, notre méthode permet une mesure précise et la comparaison des signaux fluorescents ou sans photoblanchiment lumière de diffusion commun à des reconstructions 3D d&#39;embryons monté longitudinalement.

Nous présentons ici un protocole de montage pour teinté<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons dans une position verticale qui permet l&#39;imagerie des sections en utilisant la microscopie confocale.

Imagerie verticale de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Plusieurs gradients morphogénétiques et mouvements cellulaires bien connus se produisent le long de l'axe dorsal/ventral de l'embryon de Drosophila. Cependant, l'actuel...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir des images en vue coronaire d'embryons oph intacts à l'aide de la microscopie confocale, images qui pourront être utilisées pour mesurer précisément la taille de l'embryon et quantifier les niveaux d'expression des protéines et des ARN. Ceci est réalisé en utilisant un milieu de montage de consistance gélatineuse afin d'englober les embryons et de les positionner verticalement. Dans un premier temps.Les embryons sont alignés sur une fine couche de gelée de glycérine, puis recouverts d'une deuxième couche de ce milieu. Ensuite, le milieu de montage contenant les embryons est découpé en blocs, que l'on peut retourner verticalement pour les maintenir en place. Les embryons ainsi positionnés permettent d'obtenir des résultats d'imagerie fournissant des images de sections transversales visualisées à l'aide d'un microscope confocal quelconque.Bonjour, je m'appelle Milu. Je suis étudiante diplômée au Meso Lab, département de biologie de l'Université Case Western Reserve. Aujourd'hui, nous allons démontrer un protocole de montage pour l'imagerie d'embryons PHI en position latérale à l'aide d'un microscope confocal.Nous avons mis au point cette méthode au cours du laboratoire de notre cours de biologie du développement à Case, en collaboration avec le Dr. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la technique d'imagerie Endon développée par le laboratoire Mindin, est qu'elle permet une préparation et une visualisation simples d'embryons ou de tissus fixés de n'importe quelle taille et forme. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons dû visualiser des coupes transversales d'embryons très petits d'autres espèces de gesso, dont la section manuelle aurait été très difficile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la biologie du développement en permettant des quantifications précises de l'expression des gènes et des niveaux de protéines le long de l'axe dorso-ventral.En général, les embryons sont montés longitudinalement. Bien qu'il soit possible d'obtenir des reconstructions de sections transversales avec Zack, il existe souvent un problème de photoblanchiment et de diffusion de la lumière provenant des yeux fluorescents, et cette méthode est très longue. Notre technique minimise ces problèmes, car les images de sections transversales des embryons sont visualisées le long d'un unique point confocal.En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver certaines difficultés lors de la découpe des blocs de gelée glycérinée près de l'extrémité des embryons. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle nécessite une manipulation minutieuse. Nous disposons aujourd'hui d'une démonstration réalisée par nos étudiantes, Catherine Chen et Catty, pour préparer des embryons de drosophile en vue d'une imagerie en position droite.Faites d'abord fondre la gélatine de glycérine dans un bain-marie à 55 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes, jusqu'à ce qu'elle devienne un liquide homogène en tourbillon. Ne secouez pas le flacon afin d'éviter la formation de bulles. À l'aide d'une pipette P1000 dont la pointe a été coupée, pipetez soigneusement un millilitre de gélatine de glycérine fondue sur la lame.Pour obtenir une première couche mince et uniforme sans bulles d'air, laissez la gelée durcir pendant cinq minutes sur une surface horizontale. Ensuite, placez la lame dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant cinq minutes. Sinon, recouvrez la lame d'un film plastique et conservez-la à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à cinq jours.Une fois que la première couche de gelée est solidifiée, amenez la lame au microscope et procédez à l'alignement des embryons. Déposez une petite quantité d'embryons colorés et de glycérol PBS à 70 % sur le côté de la première couche de gelée. Sous le microscope, alignez les embryons côte à côte selon trois à quatre colonnes par lame.Utilisez une aiguille hypodermique pour les prélever en utilisant le côté incliné de l’aiguille, comme une cuillère. Orientez soigneusement les têtes de tous les embryons dans la même direction en les faisant glisser horizontalement sur le milieu gélatineux à l’aide de l’aiguille.La configuration finale des embryons alignés sera similaire à celle décrite pour l'injection d'ADN. À l'aide d'un morceau de Kimwipe torsadé, retirez l'excès de PBS glycériné des embryons. Ajoutez délicatement entre 50 et 300 microlitres de gelée de glycérine fondue au-dessus des embryons, selon le nombre d'embryons, afin de former une deuxième couche de gelée.Enfin, refroidissez la lame à moins 20 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes, ou conservez-la à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour retirer les embryons inclus dans le glycérol de la lame afin de les observer au microscope stéréoscopique, utilisez une lame de rasoir pour couper le gel à proximité des côtés antérieur et postérieur des embryons alignés. Tenez la lame de rasoir à un angle de 90 degrés.Pour effectuer des coupes droites, ajouter de 100 à 200 microlitres de PBT froid à côté des coupes. Pour gratter délicatement la gelée située près des embryons. À l’aide d’une spatule, le PBT aide à libérer le bloc d’embryons.Transférez le bloc sur une lame de microscope sèche pour effectuer des coupes supplémentaires. Commencez par découper de plus petits blocs contenant cinq à sept embryons. Ensuite, retirez l'excès de gelée de glycérine susceptible d'interférer avec l'imagerie.Enfin, retourner les embryons inclus dans une position verticale à l’aide d’un rasoir et d’une aiguille. Pour visualiser les embryons de drosophile à l’aide d’un microscope confocal inversé, placer le bloc de gélatine contenant les embryons sur une lame de couverture. Veiller à ce que la partie de l’embryon présentant le moins de gélatine soit en contact plus étroit avec l’objectif.Si l'on utilise un microscope droit pour l'imagerie, préparez quatre empilements de colle supra. Numéro un : des lamelles servant de supports, et placez le bloc embryonnaire dans du glycérol entre les supports. Reliez les empilements à l'aide d'une lamelle plus longue pour l'analyse en microscopie confocale.Placez l'échantillon sur la platine du microscope. Vérifiez la distance de travail des objectifs à utiliser afin de déterminer si vous pouvez obtenir une image à travers tout l'embryon ou seulement partiellement, puis configurez la configuration du microscope confocal sur l'ordinateur pour commencer l'acquisition d'images comme indiqué ici. Si le protocole est correctement suivi, des images en coupe transversale d'embryons présentant une morphologie intacte peuvent être observées, car les embryons restent intacts.Cette méthode peut être utilisée pour effectuer des mesures précises de la taille des embryons et des niveaux d'expression génique le long de l'axe dorso-ventral. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 45 minutes. Il est important d'éliminer l'excès de glycérol avant de verser la seconde couche de gelée de glycérine sur les embryons.Dans le cas contraire, les deux couches peuvent se séparer et rendre l'étape de découpe plus difficile. Vous devez également vérifier la distance de travail des objectifs que vous utilisez afin de vous assurer que vous pouvez imaginer tout l'embryon ou seulement une partie, car la distance de travail limite la zone pouvant être observée. Veillez à découper la gélatine près du côté de l'embryon qui sera positionné vers l'objectif.Sinon, vous ne ferez des images que de gelée au lieu des embryons. Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous aurez bien compris comment obtenir des images en coupe transversale des embryons de Joseph. Merci de nous avoir regardés et bonne chance dans vos expériences.

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Nous décrivons un protocole détaillé utilisant la microscopie épiscopique à haute résolution pour acquérir des images tridimensionnelles (3D) d’embryons de souris. Ce protocole amélioré utilise une méthode modifiée de préparation des tissus pour améliorer la pénétration du colorant fluorescent, permettant ainsi l’analyse morphométrique d’échantillons de petite et de grande taille.

Acquisition rapide des Images 3D Utilisation de haute résolution épiscopique Microscopie

Ce protocole décrit un procédé détaillé pour la culture ex vivo à long terme et de l' imagerie en temps réel d'un disque de Drosophila imagée. Elle démontre la différenciation des photorécepteurs et la rotation ommatidial dans les 10 h de l'imagerie en direct du disque des yeux. Le protocole est simple et ne nécessite pas l'installation coûteuse.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Un protocole est présenté qui permet la visualisation de Drosophila melanogaster intact à n’importe quel stade de développement à l’aide de la tomographie microcalculée.

Imagerie d’animaux entiers de Drosophila melanogaster à l’aide de la tomographie microcalculée

Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

Ces protocoles décrivent comment caractériser l’organisation et la fonction d’occllusion des jonctions septates plissées dans l’épithélium embryonnaire de Drosophila et mutant.

Expériences d’immunocoloration et de pénétration de colorants pour définir les protéines de jonction septate plissée du noyau dans les épithélios embryonnaires de Drosophila

Découvrez un protocole de montage vertical pour embryons de Drosophila utilisant la microscopie confocale. Cette méthode permet de mesurer précisément la taille des embryons et de quantifier l'expression des protéines et de l'ARN.

Imagerie verticale de

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