Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

Les canaux potassiques rectificateurs entrants activés par les protéines G, ou grk, jouent un rôle important dans la régulation de l'excitabilité neuronale. Les gks peuvent être activés à la fois par des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), tels que le récepteur muscarinique M2R, et par l'alcool, afin d'étudier les effets de mutations au niveau du site de fixation de l'alcool sur le gerk. Après activation, une mutation ponctuelle est introduite dans l'ADNc du grk par mutagenèse dirigée sur site ; les constructions purifiées de gerk sont transfectées, conjointement avec des constructions YFP, dans des cellules de mammifères, et l'efficacité du transfection est évaluée par imagerie de fluorescence.

L'analyse par enregistrement en mode « whole cell » est ensuite réalisée afin de comparer l'activation dépendante de l'alcool et des protéines G. Cette démonstration expérimentale visuelle vous fournira des informations essentielles sur la manière d'étudier la fonction des canaux LY. Aujourd'hui, nous allons examiner une question portant sur la façon dont l'alcool active les canaux de groupe.

La technique de néogenèse dirigée sur site présentée ici peut fournir des informations sur la fonction des canaux ioniques. Cette technique peut également être appliquée à d'autres systèmes dans lesquels une mutation d'un gène est connue pour provoquer une maladie humaine. Ces démonstrations de la technique de patch-clamp en cellule chaude sont essentielles, car de nombreuses étapes exigent une grande précision, une compensation électronique adéquate et une pratique rigoureuse afin de produire des données exploitables.

L'ADN utilisé pour la transfection dans ce protocole est préparé comme suit. Tout d'abord, la sous-unité GRK, obtenue par PCR, est directement clonée dans le plasmide d'expression mammalien. Des mutations ponctuelles sont introduites dans le plasmide pCDNA 3.1 à l'aide d'amorces spécifiquement conçues, en combinant le kit de mutagenèse dirigée Quick Change XL à deux sites.

En utilisant ce système, une PCR est réalisée au cours de laquelle tout le plasmide est répliqué, et des mutations ponctuelles encodées par les amorces sont introduites. Après la PCR, les plasmides répliqués sont digérés par l'enzyme de restriction DpnI, puis transformés par choc thermique dans des cellules d'Escherichia coli XL10-Gold ultra-compétentes. Les bactéries transformées sont cultivées sur des boîtes de gélose LB contenant de l'ampicilline ; les bactéries hébergeant le plasmide sont résistantes à l'ampicilline et forment des colonies.

Les colonies isolées sont prélevées et cultivées dans des mini-cultures. Des miniprélèvements sont effectués pour isoler l'ADN plasmidique. L'ADN est ensuite séquencé afin d'identifier les mutants ayant été correctement transformés.

Des E. coli sont cultivés en plus grande quantité et des préparations de type « maxi prep » sont réalisées afin d'obtenir de plus grandes quantités d'ADN plasmidique. Ensemencez environ 1 × 10⁵ cellules HEC 293T dans chacun de deux puits d'une plaque de 12 puits, un pour le mutant et un pour le témoin de type sauvage. Incubez à 37 degrés Celsius.

Après huit à 24 heures, les cellules adhéreront à leur substrat et seront prêtes pour la transfection. Transfectez les cellules avec le lipo 2000 selon les instructions du fabricant, en utilisant 0,2 microgramme d'ADNc du canal, 0,4 microgramme d'ADNc du récepteur M2R et 0,04 microgramme d'ADNc-YFP. Pour identifier les cellules transfectées avec succès, incubez les cellules pendant 24 heures.

Une fois le temps d'incubation souhaité écoulé, placez les cellules sur la platine d'un microscope à fluorescence inversé pour déterminer l'efficacité de la transfection. Comparez les images fluorescentes et celles en contraste de phase (DIC) afin de déterminer le pourcentage de cellules transfectées. Replacez la boîte de culture dans l'incubateur.

Nettoyez des lamelles en verre de 12 millimètres et conservez-les dans de l'éthanol jusqu'à utilisation. Éliminez l'éthanol résiduel par flamboiement dans l'enceinte stérile. Placez les lamelles dans une plaque de 24 puits et recouvrez-les avec 0,2 milligramme par millilitre.

Poly-L-lysine 24 heures après la transfection, trypsinez les cellules et semez quatre fois dix puissance trois cellules par puits, dans quatre à huit puits d'une plaque de 24 puits contenant des lamelles en verre revêtues de poly-L-lysine. Incubez pendant 24 à 48 heures supplémentaires avant de réaliser le patch-clamp en configuration whole-cell. Préparez les électrodes de patch à l’aide d’un tireur vertical en deux étapes et de verre borosilicaté pour électrodes.

Idéalement, l'électrode terminée aura une résistance de trois à sept mégohms et ne nécessitera aucune manipulation supplémentaire, comme le polissage thermique. Pour le scellement en mode patch, placez une lame couvre-objet contenant les cellules transfectées dans une boîte de 35 millimètres contenant une solution externe à 20 millimolaire de potassium ou 20 K. Placez la boîte sur la platine d'un microscope à fluorescence inversé.

Le dispositif de patch-clamp utilisé ici intègre un système de perfusion. Ce système contient les solutions extracellulaires qui seront appliquées aux cellules par gravité à travers des tubes reliés à un collecteur. Chaque solution est contrôlée à distance à l'aide d'une vanne à pincement électromagnétique.

Utilisez le contraste interférentiel différentiel (DIC) pour faire la mise au point et localiser les cellules. Passez au filtre YFP pour repérer les cellules positives au YFP. Une fois les cellules positives au YFP identifiées, positionnez l'extrémité du système de perfusion près de la cellule fluorescente, à 20 à 30 micromètres ou à deux ou trois longueurs cellulaires de distance.

Remplissez une électrode avec la solution interne de l'électrode. À l’aide d’une seringue et d’une aiguille souple, tapez doucement sur l’électrode remplie pour éliminer les bulles d’air présentes à l’extrémité. Fixez les électrodes sur le préamplificateur de l’amplificateur AXO patch 200 B.

Vérifiez que les paramètres sur l'amplificateur correspondent à nouveau à une configuration donnée. Le commutateur en mode cellule entière est en position bêta égale à un, et le filtre passe-bas est réglé à 10 kilohertz. Appliquez une pression positive à l'aide de la seringue et du clamp pour maintenir la pointe de l'électrode propre.

Ensuite, utilisez un micromanipulateur pour placer la pointe de l'électrode dans le bain et déplacez-vous au-dessus de la cellule. Passez l'amplificateur en mode V track et le bouton du voltmètre en V track. Utilisez ensuite le voltmètre de potentiel de compensation de la pipette sur l'amplificateur pour régler à zéro le potentiel de la pipette en amenant la tension affichée sur le voltmètre de l'amplificateur à 0,00.

Alternativement, passez en mode de blocage en tension sur l'amplificateur et sélectionnez le bouton d'impulsion de test pour appliquer un saut de tension de test. Le saut de tension rectangulaire apparaîtra dans la fenêtre de test d'étanchéité du blocage. Ajustez le décalage de la pipette sur l'amplificateur afin de ramener le courant de base à zéro nanoampère.

Le test d'étanchéité affichera la résistance de l'électrode, qui doit être comprise entre trois et sept mégohms. Ensuite, fermez la fenêtre du test d'étanchéité. Sélectionnez le protocole d'acquisition ouvert dans le menu déroulant.

Ensuite, sélectionnez un protocole de tension enregistré. Ici, le protocole sélectionné a été préprogrammé pour appliquer un unique palier de tension à moins 100 millivolts, puis une rampe jusqu'à plus 40 millivolts toutes les deux secondes. Ce protocole en rampe permet d'observer le potentiel de retournement ainsi que la propriété de rectification entrante des canaux GK.

Pour les canaux ioniques activés par le voltage, une impulsion rectangulaire de tension peut être plus appropriée ; utilisez le réglage fin du micromanipulateur pour approcher la cellule, relâchez la pression positive, puis, après avoir touché la surface de la cellule, appliquez une légère pression négative. Surveillez l'augmentation consécutive de la résistance lors du test d'étanchéité. Une fois que la résistance atteint la gamme du gigao-hm, l'électrode est scellée à la membrane.

On appelle cela un scellé gigaseal. À l’aide d’une seringue, appliquez une impulsion de pression négative pour rompre la membrane et accéder à l’intérieur de la cellule. Une fois en configuration de cellule entière, le test de scellé enregistrera de forts courants capacitifs visibles sous forme de pics ou de transitoires au début et à la fin du test.

Test de pulsation dans le joint. Ensuite, cliquez sur le bouton de test de membrane. Dans le clamp X, enregistrez la résistance d'accès et la résistance de membrane.

Une capacité membranaire notée dans un cahier de laboratoire permet de vérifier à l'œil nu l'ajustement exponentiel. La capacité membranaire est proportionnelle à la taille de la cellule et sera utilisée pour calculer la densité de courant accessible. La résistance d'accès et la résistance membranaire sont utilisées pour évaluer si l'enregistrement sera satisfaisant pour poursuivre l'expérience.

Un bon enregistrement présentera une faible résistance d'accès. Fermez maintenant la fenêtre de test de membrane et cliquez à nouveau sur le bouton de test d'étanchéité dans la fenêtre de test d'étanchéité ; réglez V out à moins 40 millivolts pour compenser la capacité membranaire et la résistance en série sur l'amplificateur, activez le condensateur whole cell, puis ajustez alternativement le condensateur whole cell et la résistance en série jusqu'à ce que le transitoire soit minimisé et que le courant forme une ligne plate. Si nécessaire, ajustez la capacité de la pipette à l'aide du bouton de réglage rapide (fast cap) sur l'amplificateur.

Un excès ou un défaut de compensation laissera un transitoire de capacité résiduelle. Ensuite, tournez le bouton de prédiction en pourcentage vers 60 à 80 % et réajustez la résistance en série du condensateur en mode cellule entière et le condensateur rapide selon les besoins, afin d'obtenir une ligne plate lors du test d'étanchéité. Enfin, tournez la compensation en pourcentage à environ 100 % sans faire osciller la cellule, tout en essayant de maintenir l'impulsion aussi linéaire que possible en réajustant les potentiomètres de la résistance en série du condensateur en mode cellule entière et du condensateur rapide.

Une fois la compensation de la résistance et de la capacité réalisée, notez dans un cahier de laboratoire la valeur réglée pour le pourcentage de résistance série de capacité de l'amplificateur, le pourcentage de prédiction de compensation et le temps de latence, puis ouvrez la vanne de la solution externe pour la solution bain 20 K contrôle. Réglez le filtre passe-bas du bain sur l'amplificateur à deux kilohertz. Ensuite, commencez l'enregistrement des courants en cliquant sur le bouton d'enregistrement dans le logiciel.

Rechercher la propriété de rectification entrante du courant ger. Celle-ci se manifeste par un courant entrant important, négatif par rapport au potentiel de renversement du potassium, déterminé par l'équation de Nernst EK, et un faible courant sortant, positif par rapport à ek. Après avoir enregistré une ligne de base stable, déterminer l'activation médiée par le récepteur des courants en appliquant la solution extracellulaire 20 k plus du carbacol.

Une fois l'activation maximale observée et que le courant atteint un état stable, revenir à la solution de bain K et attendre que le niveau de courant de base soit atteint. Ensuite, pour étudier l'activation par l'alcool des courants gert, passer à la solution externe contenant 20 k plus 100 millimolaire d'éthanol et attendre la réponse maximale.

Ensuite, revenir à la solution bain 20 K et attendre jusqu'à ce que le niveau de courant de base soit atteint. Enfin, pour déterminer les courants basaux de gert, passer à la solution contenant 20 K plus 20 K de baryum et attendre la réponse ici. L'inhibition du courant gerk doit être évidente, étant la plus marquée à moins 100 millivolts tout au long de la procédure.

Notez le numéro de balayage du tracé correspondant à l'application de différentes solutions extracellulaires. Un seul fichier de courbe enregistré contiendra tous les balayages pour l'ensemble de l'expérience. Pour analyser les données de GK, utilisez le logiciel Clamp FIT 8.2.

Suivant les instructions du protocole écrit joint, deux enregistrements distincts ont été obtenus à partir de cellules HEC 2 9 3 T exprimant soit des canaux GK de type sauvage, soit des canaux mutants, puis analysés conformément aux instructions de cette vidéo, comme illustré ici pour le GK de type sauvage deux. Le panneau de gauche contient une fenêtre montrant plusieurs courants superposés, générés par le protocole de rampe de tension en présence de différentes solutions. Remarquez la rectification entrante.

C'est le courant entrant plus important à moins 100 millivolts vers 50 millisecondes sur l'enregistrement du courant. Le petit courant sortant entre zéro et plus 40 millivolts vers 200 à 260 millisecondes sur l'enregistrement du courant provient d'un canal potassique à activation voltage-dépendante endogène. Ce n'est pas le courant Gert.

Un curseur est placé sur le courant entrant maximal, et les valeurs des curseurs sont inscrites dans le tableur. Dans le tableur, le numéro de la trace et le courant à moins 100 millivolts sont indiqués.

Les données comprennent le courant de base, les courants induits par la carbamylcholine et les courants provoqués par l'alcool, ainsi qu'un courant inhibé par le baryum. De même, les courants en rampe de tension en présence de différentes solutions sont présentés : 20 k plus 100 millimolaire d'éthanol ou 20 k plus 5 millimolaire de carbamylcholine ou 20 k plus du baryum, pour le canal muté L 2 57 w.

Remarquez les courants induits par l'alcool et le carbo alcool nettement plus faibles. Ces résultats suggèrent que ce résidu joue un rôle important dans la régulation des canaux GK par l'alcool et les sous-unités g bêta gamma. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de construire une mutation dans un gène et de commencer à étudier son effet sur la fonction du canal en utilisant des techniques électrophysiologiques avancées.

Une fois maîtrisée, cette technique de néogenèse dirigée peut être réalisée en deux à trois jours et être étendue à cinq mutations ou plus. Le développement de ces techniques a permis aux biophysiciens des canaux ioniques d'explorer les propriétés fondamentales de la fonction et de la régulation des canaux ioniques. En outre, elles permettent aux chercheurs d'étudier les maladies humaines provoquées par une mutation unique dans un gène de canal ionique.