Name: Microinjection dembryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 39 s
Description: Apprenez la microinjection d'embryons d'Aedes aegypti pour générer des moustiques transgéniques. Cette méthode démontre la préparation des aiguilles, la désiccation des embryons et l'injection pour contrôler les vecteurs de la dengue.

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Préparation à l&#39;avance de la microinjection <ol><li> Moustiques nourrissent de sang: pour l&#39;injection du lundi au vendredi femelles se nourrissent sur le jeudi précédent. </li><li> Préparer des aiguilles de verre en utilisant le programme 3 ou 2 (voir matériaux). </li><li> Pose du tube pour le flacon de culture des embryons est la drosophile. Coton humide dans le fond, avec un disque de papier filtre humide qui la recouvre. </li><li> Préparer lamelle en plastique en collant double-face de la cassette à une extrémité. Bande de garniture à lamelle afin qu&#39;elle se termine au bord de lamelle. </li><li> Préparer l&#39;huile pour la dessiccation (voir Matériaux) </li><li> 150 bécher en plastique avec un coton humide dans le fond, recouvert d&#39;un disque de papier filtre humide (80mm Whatman) pour garder les embryons après l&#39;injection. </li></ol> Mise en place de la pose forcée <ol><li> Recueillir le sang de 60 à 10 femelles nourries avec l&#39;utilisation d&#39;un aspirateur et de les transférer dans le flacon de culture de drosophiles avec du coton humide et du papier filtre. </li><li> Mettez les moustiques de nouveau dans des conditions insectory dans l&#39;obscurité, et de permettre à pondre des oeufs pour 1h et 15min. </li><li> Laissez adultes volent dans la cage et retirez le disque de papier filtre avec des embryons. </li><li> Pour aligner les œufs, le faire sous microscope à dissection. En utilisant des pinces fines n ° 5 ou un pinceau fin, choisissez gris à gris-noirâtre embryons et d&#39;organiser en ligne sur le carré de papier Whatman 3MM imbibé d&#39;eau. Tous les embryons doivent être dans la même orientation, comme l&#39;injection doit être au pôle postérieur. L&#39;extrémité antérieure de l&#39;embryon est légèrement plus large que le postérieur. Sécher le papier filtre avec des embryons par pressage à sec du papier filtre pour le (les choses mouillées ne colle pas à la bande). Pour transférer les œufs, inverser la diapositive contenant l&#39;adhésif double-face et appuyez doucement contre les oeufs. L&#39;extrémité postérieure des œufs doivent être très proches du bord de l&#39;adhésif double face. </li><li> Dessécher les embryons environ 1 min. à température ambiante. Ils commencent à fossette légèrement en séchant. </li><li> Couverture embryons desséchés avec de l&#39;huile d&#39;halocarbures pour éviter la dessiccation plus loin. </li></ol> Microinjection des embryons <ol><li> L&#39;aspect le plus important de l&#39;injection est la qualité de l&#39;aiguille (voir matériaux). </li><li> Remplir une seringue avec la solution d&#39;ADN à injecter en utilisant un microloader. Très peu d&#39;une solution d&#39;injection est nécessaire: 1 à 2 pl. </li><li> Connectez l&#39;aiguille à la Transjector, qui contrôle le temps d&#39;injection (Manu) et la pression (600), et la contre-pression (250). La microinjection est réalisée à l&#39;aide d&#39;un microscope avec une scène en mouvement (Leica) à un grossissement x 10 et micromanipulateur. Si nécessaire, une platine de microscope peut être soulevé par l&#39;empilement de préparer des lames de microscope 4-5. Placer la lamelle transportant des embryons sur scène surélevée. Injecter embryons horizontalement pour empêcher la déchirure de l&#39;endochorion; pénétration doit être au pôle postérieur. Pour l&#39;injection, je garde l&#39;aiguille immobile et déplacer le platine du microscope. </li><li> Injecter de 0.2 à 0.5 nl de solution, correspondant à environ 1-5% du volume d&#39;embryon. Contrôle du volume d&#39;injection en ajustant la pression d&#39;injection et de temps. Le peu baissée, les embryons desséchés devraient retrouver leur injection turgescents après la comparution. </li><li> Choisissez embryons de la lamelle à l&#39;aide de pinces fines ou un pinceau fin, et les placer dans un récipient en plastique avec du coton humide et humide papier filtre. Couverture bécher avec du papier absorbant. Gardez en place avec un élastique autour de la jante et le retour à des conditions insectarium pour 4 jours. </li></ol> Post-injection <ol><li> Quatre jours après, soigneusement le papier d&#39;embryon lieu, l&#39;embryon vers le bas, sur l&#39;eau en grande boîte en plastique avec une petite quantité de nourriture. Les embryons éclosent sur une période très longue: ne jetez pas la culture au moins jusqu&#39;à 4-5 semaines après l&#39;injection. </li></ol> Remarques L&#39;ADN pour l&#39;injection Solution d&#39;ADN plasmidique pour l&#39;injection a été isolé en utilisant Endofree kit plasmide. Construire et mélanger plasmide assistant ensemble à la concentration juste, précipités avec izopropanol. Le culot a été lavé avec de l&#39;éthanol 70% avant la remise en suspension dans le tampon d&#39;injection. Avant l&#39;injection, l&#39;ADN propre à l&#39;aide Millex-GV colonne.

<table><tbody><tr><td>Solution d'injection 1x</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>5mM KCl, 0,1mM phosphate de sodium, pH 6,8</td></tr><tr><td>Plasmide de construction</td><td>ADN</td><td></td><td></td><td>0,5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Plasmide auxiliaire</td><td>ADN</td><td></td><td></td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>Kit EndoFree Plasmid</td><td>Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne Millex-GV</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>Pour purifier l'ADN.</td></tr><tr><td>Tireur de capillaires en verre</td><td>Instrument</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modèle P-87</td><td>Chaleur-815, Traction-10, Vitesse-10, Temps-100. Chaleur-700, Traction-30, Vitesse-36, Temps-50</td></tr><tr><td>Tireur de capillaires en quartz</td><td>Instrument</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modèle P-2000</td><td>Chaleur-275, Filament-3, Vitesse-38, Délai-250, Traction-141</td></tr><tr><td>Aiguilles en verre pour micro-injection</td><td></td><td></td><td></td><td>Préparées en étirant un tube capillaire pour obtenir une pointe fine de 3 à 8 µm et une tige d’environ 100 à 300 µm à l’aide d’un tireur de micropipettes. Lorsque l’aiguille est neuve, sa pointe est scellée et se rompt généralement lors de la première ou de la deuxième injection ; sinon, la pointe de l’aiguille en verre peut être amincie à l’aide d’un affûteur de micropipettes de type Brown (Sutter Instrument).</td></tr><tr><td>Aedes aegypti</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Mâles et femelles de moustiques, pour obtenir des embryons.</td></tr><tr><td>Flacon de culture de Drosophile</td><td></td><td></td><td></td><td>Pour la ponte des œufs de moustique.</td></tr><tr><td>Huile d’halocarbone</td><td>Réactif</td><td></td><td></td><td>Huile pour la dessiccation : huile d’halocarbone 700 : huile d’halocarbone 27 (1:1)</td></tr><tr><td>Pince n°5</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petit pinceau fin</td><td></td><td>Kolinsky Sable</td><td>n° 0000</td><td></td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microchargeur</td><td>Outil</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Transjector</td><td>Outil</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Avec plateau mobile et micromanipulateur.</td></tr><tr><td>Papier Whatman 3MM</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ruban adhésif double face</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection d&#39;embryons aegypti a. pour obtenir les moustiques transgéniques

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Dans cette vidéo, Nijole Jasinskiene démontre la méthodologie employée pour générer transgéniques moustiques Aedes aegypti, vecteurs de la dengue. Les techniques pour la préparation correcte des aiguilles de microinjection, desséchants embryons, et effectuant la microinjection sont démontrés.

Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

Dans cette vidéo, Nijole Jasinskiene présente la méthodologie employée pour générer des moustiques Aedes aegypti transgéniques, qui sont des vecteurs de la dengue...

Je suis ya. Je travaille dans le laboratoire d'Anton James. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment réaliser une microinjection dans des embryons de moustiques ADIs d'Égypte afin d'obtenir des moustiques transgéniques.Pour obtenir les embryons destinés aux micro-injections, nous devons disposer de femelles nourries au sang. Les femelles doivent être nourries le jeudi. Si vous souhaitez effectuer une micro-injection du lundi au vendredi, cela constitue également une erreur.Je prends le coton, je le place et je verse l'eau. Le coton doit être mouillé ; je prends un cercle Whiteman de 3 mm, je le place sur le dessus et je pousse vers le bas. Ensuite, je dois verser l'eau, utiliser un chiffon propre, une serviette, puis fermer avec du coton.Ceci est prêt. Maintenant, je vais prélever six groupes de 10 femelles et je transfère les femelles afin de les maintenir en repos pendant un court moment, puis je vais les placer dans des conditions sombres et les introduire dans une chambre maintenue à 27 degrés Celsius pendant une heure et quinze minutes. Je prépare des aiguilles pour micro-injection en utilisant des aiguilles en verre, avec un appareil de type P-87 de la société Polar Shuttle

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire de James à injecter dans les ARNdb femelles moustiques A. aegypti, qui abritent le virus de la dengue. La technique pour l'étalonnage des aiguilles d'injection, de manipuler la configuration d'injection, et l'injection ARNdb dans le thorax est illustré.

L&#39;injection d&#39;ARNdb dans Femme Mosquitos aegypti A.

Moustiques Anopheles stephensi sont des vecteurs de la malaria qui habitent en Inde et en Asie. Cette vidéo montre la technique pour effectuer des micro-injections de cette espèce avec des transgènes qui confèrent une résistance à la malaria au moustique. Une grande partie de la méthodologie démontrée dans cette vidéo est applicable à des techniques de micro-injection d'autres espèces de moustiques.

Injection d&#39;un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

Dans cette vidéo, nous démontrons l’intégration du transgène spécifique au site médiée par phiC31 dans l’embryon d’Anopheles par microinjection. Cette méthode permet d’introduire les gènes souhaités dans un système hôte pour la recherche et les applications industrielles.

Intégration de transgènes dirigée par phiC31-Integrase : une technique de micro-injection pour l’intégration de transgènes spécifiques à un site dans un vecteur d’anophèles

Dans cette vidéo, nous démontrons l’administration de la construction du forçage génétique dans l’embryon du moustique Anopheles gambiae grâce à la technique de micro-injection embryonnaire. Cette procédure permet d’intégrer la construction de l’ADN livrée, par recombinaison homologue, dans les cellules germinales pour générer une population de moustiques transformée.

Microinjection d’embryons de moustiques : une technique pour délivrer de l’ADN exogène dans le jaune d’embryon d’Anopheles gambiae afin de générer des mutations germinales

La mouche méditerranéenne des fruits (medfly) Ceratitis capitata (Diptera : Tephritidae) est un ravageur mondial de l’agriculture. Une meilleure compréhension de sa biologie est essentielle pour contrôler les populations de mouches et ainsi réduire l’impact économique. La micro-injection embryonnaire est un outil fondamental permettant à la fois la transformation de la lignée germinale et l’étude de la génétique inverse chez cette espèce.

Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Nous rapportons en utilisant une artificiel intronic petit RNA expression stratégie à élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Une procédure détaillée pour la construction, emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV aussi bien en ce qui concerne l’infection larvaire est décrite.

Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.

Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 est de plus en plus utilisé pour caractériser la fonction des gènes dans les organismes non modèles. Ce protocole décrit comment générer des lignées knock-out de Culex pipiens,de la préparation de mélanges d’injection à l’obtention et à l’injection d’embryons de moustiques, ainsi que la façon d’élever, de croiser et de dépister les moustiques injectés et leur progéniture pour les mutations souhaitées.

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Le protocole décrit comment obtenir des modifications dirigées par le site dans le génome des moustiques du paludisme anophèles en utilisant le système φC31 . Les modifications décrites comprennent à la fois l’intégration et l’échange de cassettes transgéniques dans le génome des lignes d’amarrage portant attP.

Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Les techniques de micro-injection sont essentielles pour introduire des gènes exogènes dans les génomes des moustiques. Ce protocole explique une méthode utilisée par le laboratoire James pour microinjecter des constructions d’ADN dans des embryons d’Anophèles gambiens afin de générer des moustiques transformés.

Méthode de micro-injection pour les embryons d’anophèles gambiens

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Édition du génome du moustique de la fièvre jaune Aedes aegypti à l’aide de CRISPR-Cas9

Apprenez la microinjection d'embryons d'Aedes aegypti pour générer des moustiques transgéniques. Cette méthode démontre la préparation des aiguilles, la désiccation des embryons et l'injection pour contrôler les vecteurs de la dengue.

Microinjection d'embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

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