Name: Croissance et différenciation des cellules adultes hippocampe Arctic écureuil souches neurales au sol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez la culture et la différenciation des cellules souches neurales du hippocampe d'écureuils arctiques adultes. Cette méthode permet d'obtenir des neurones et des cellules gliales pour étudier la neurogenèse et les effets ischémiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par l&#39;US Army Medical Research et le Commandement du matériel octroi # 05178001 et par NS041069-06 de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies. Nous remercions Joël Vonnahme des commentaires utiles sur le protocole.

1. Cellule AGS souches neurales et les médias Préparation <ol><li> Adulte hippocampique écureuil au sol de l'Arctique (AGS) des cellules souches neurales isolées dans une manière décrite précédemment 9 peut maintenant être obtenu commercialement comme flacons cryopréservés. Les cellules sont expédiés dans des emballages nuit isolée contenant de la glace sèche pour s'assurer que les cellules restent dans un état cryopréservés. Pour maintenir l'intégrité, déballer les cellules immédiatement après la réception et stocker à plus bas que -150 ° C, ou dans la phase vapeur de l'azote liquide Dewar. </li><li> Préparer agsNSC milieu de base + 5% de FBS en ajoutant 5 ml de FBS (LS-1012) à 95 ml agsNSC milieu de base </li><li> Préparer moyen d'extension agsNSC en ajoutant 500 B-27 uL Supplément (Invitrogen) à 50 mL agsNSC milieu de base. Répartissez le reste de la B27 dans 1mL aliquotes et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation. </li><li> Chaude 25 ml de milieu de base + 5% agsNSC FBS et 20 ml de milieu Expansion agsNSC dans un bain à 37 ° C l'eau. </li><li> Manteau flacons utilisés pour l'expansion de poly-L-ornithine <ol><li> Décongelez la solution de poly-L-ornithine (10 pg / ml) de travail. Conserver la solution à 2-8 ° C pendant jusqu'à un mois une fois décongelé. </li><li> Ajouter 8 ml de poly-L-ornithine solution de travail à l'un ventilé T-75 flacon et répartir uniformément la solution sur toute la surface de culture de la fiole. (Ajuster quantité de solution de travail pour les navires de la culture d'autres qui peuvent être utilisés Utiliser 0,5 -.. 1,0 ml de poly-L-ornithine solution de travail par 10 cm de surface de culture 2) </li><li> Incuber flacons à 37 ° C pendant un minimum de 24 heures. (L'utilisation d'un incubateur sans ajouter du CO 2 est préféré pour l'incubation de poly-L-ornithine récipients de culture enduits.) Flacons couchés peuvent être stockées pendant jusqu'à deux semaines dans l'incubateur. </li><li> Avant d'utiliser, aspirer poly-L-ornithine solution de travail de la fiole et laver deux fois avec de l'eau stérile pour culture de tissus. Aspirer le liquide jusqu'à ce que le flacon est presque à sec avant utilisation. </li></ol></li><li> Supprimer un flacon de la Dewar et vérifier que le bouchon du flacon est correctement scellé. Tenir le haut du flacon en laissant la moitié inférieure de la fiole dans un bain d'eau à 37 ° C pendant environ 60-90 secondes ou jusqu'à ce que le flacon est presque complètement décongelés; une petite quantité de glace doit toujours être visible. Pour éviter une contamination potentielle, gardez le bouchon du flacon de l'eau. Ne pas trop dégel, car cela pourrait endommager les cellules. </li><li> Vaporiser l'extérieur de la fiole avec de l'éthanol à 70% ou isopropanol, puis placer le flacon dans une enceinte de sécurité biologique. Retirez le bouchon avec précaution pour éviter la contamination ou les éclaboussures. </li><li> Doucement remettre en suspension les cellules dans le flacon en ajoutant 1 ml de milieux de base agsNSC + 5% de FBS aide d'une pipette stérile. Transférer les cellules remises en suspension à 25 ml d'eau tiède moyen basal agsNSC + 5% SVF dans un tube à centrifuger de 50 ml. </li><li> Rincer la cryo-flacon une fois avec la suspension cellulaire diluée. Centrifuger les cellules à 150 xg pendant 6 minutes. Pour de meilleurs résultats, calculer la vitesse pour chaque type de centrifugeuse individuelle. </li><li> Alors que les cellules sont filer vers le bas, ajoutez 10 ml de milieu d'expansion à l'agsNSC sèche de poly-L-ornithine T-75 revêtement des fioles, ajouter 40 ul de rh FGF-base (40ng/mL). Après la centrifugation, aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas aspirer le culot. Re-suspendre les cellules dans 10 ml de milieu Expansion agsNSC. Transférer les cellules remises en suspension dans un milieu de agsNSC expansion dans les médias dans le ballon de T-75. </li><li> Secouez doucement le récipient de culture côte à côte afin de répartir uniformément les cellules dans le vaisseau. </li><li> Récipient de culture ensemencée en place de 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Les cellules doivent attacher le ballon et commencent à former des processus dans les deux heures de l'ensemencement. Si les cellules restent flottants et en boule dans le milieu, puis centrifuger les cellules de 5% de FBS et exécutez les étapes 1.8 à 1.10 avec un milieu frais et de fiole. </li></ol> 2. Expansion des AgsNSC <ol><li> Deux jours (~ 48 heures) après la décongélation et l'ensemencement des cellules, un remplacement plein milieu devrait être effectuée en utilisant 20 ml de milieu Expansion agsNSC plus un pic 40 uL de rh FGF-base. </li><li> Flacons de Spike avec 40 uL de rh FGF-base sur l'inoculation jour suivant. Les cellules seront prêtes à trypsiniser quand ils ont atteint la confluence de 75-80% par la troisième ou quatrième jour après l'inoculation. La culture des cellules souches indifférenciées pendant plus de 4 jours après l'inoculation n'est pas recommandée car incubation plus longue permettra aux cellules commencent à se différencier pour les neurones et les neurones peuvent être blessés par trypsinisation pendant l'étape 3. Le FGF-RH de base peuvent être conservés à 4 ° C pendant une semaine et toujours maintenir l'activité. Le FGF-rh base peut également passer par un gel des supplémentaires / dégel à -20 ° C si plus de temps est nécessaire. </li></ol> 3. Trypsinisation des cellules <ol><li> agsNSC doivent être repiquées 3 à 4 jours après l'inoculation. Préparer un flacon de poly-L-ornithine enduit entre 24 heures et une semaine avant repiquage si l'agsNSC sera élargi à nouveau. </li><li> Aspirer lemoyenne du récipient de culture. Ajouter 2,5 ml de 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) à la cuve pour chaque 75 cm 2 de surface. Agiter doucement pour s'assurer que toutes les cellules sont recouvertes avec la trypsine / EDTA. Les cellules commencent normalement à se détacher de la surface dans les 60 secondes, en fonction de la confluence des cellules. Ne pas trop trypsiniser, car cela pourrait endommager les cellules. Tapotant doucement le récipient de culture de plusieurs côtés encouragera le détachement. </li><li> Une fois que les cellules se détachent, ajouter 10 ml de milieu de base + 5% agsNSC FBS dans le ballon. Remuer doucement pour assurer l'ensemble de la solution de trypsine est neutralisée. En utilisant des techniques de laboratoire d'asepsie, une pipette les cellules dans un tube à centrifuger stérile contenant 10 ml de FBS agsNSC basale moyenne 5%. Répétez en lavant le flacon à nouveau avec un supplément de 10 ml de milieu de base + agsNSC 5% de FBS et de combiner avec le premier lavage. </li><li> Centrifuger les cellules à 150 xg pendant 6 minutes comme décrit ci-dessus. Après centrifugation, les cellules doivent former un nettoyage granulés en vrac. Aspirer la trypsine neutralisée et moyennes du tube de centrifugation et de remettre en suspension les cellules dans 10 ml granulés (par T-75 flacon) de pré-chauffé moyen basal agsNSC + 5% de FBS par un léger pipetage haut et en bas 2X avec une pipette de 10 ml. Effectuer une numération cellulaire comme décrit ci-dessous. </li></ol> 4. Calcul standard pour le placage des cellules <ol><li> En utilisant une technique aseptique, tourbillon de la suspension cellulaire et le transfert 15 ul de la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger. Ajouter 15 ul de 0,4% au bleu Trypan. Mélanger doucement et une charge de 10 uL de suspension cellulaire à chacune des chambres d'un hématimètre propres comme une ligne lumineuse Comptage Chambre (catalogue # 1490: Hausser scientifique, <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a> ). </li><li> Comptez un minimum de 4 quadrants sur l'hématimètre. Les cellules bleues qui sont positifs pour Bleu Trypan sont morts et ne doivent pas être comptés. Pour nombre de cellules précises, le nombre optimal de cellules par quadrant devrait être de 25 à 75 cellules. </li><li> Après comptage des cellules, de calculer la moyenne des quatre quadrants. Multipliez le nombre moyen de cellules par 10 000 et par le facteur de dilution (2 si vous utilisez les volumes recommandés) pour déterminer le nombre de cellules par mL. Notez que si la viabilité pourcentage total est inférieur à 92% il peut y avoir un certain nombre de causes. Une des raisons de faible viabilité peut être plus trypsinisation, avant neutralisation par la trypsine de FBS. Une autre raison peut être que la concentration de sérum (FBS) à la trypsine est trop faible et les cellules continuent à être traitées à la trypsine. Troisièmement, les cellules peuvent avoir été trop confluentes, causant des cellules souches à se différencier en raison de contact cellule-cellule, conduisant à des blessures lors de trypsinisation. Si cette méthode est suivie de près un rendement de 3 ou plus doublements on peut s'attendre, ce qui donne une population de&gt; 4.000.000 cellules à partir d'un nombre initial de 500 000 ~. </li></ol> 5. L'inoculation d'un autre flacon Expansion <ol><li> Pour déterminer le nombre total de cellules nécessaires pour inoculer un navire, il faut multiplier la densité de semis souhaitée (6600 cellules par cm 2 ou 500 000 cellules par flacon T-75) par la surface (en cm 2) du navire à être inoculés. Si l'inoculation plus d'un navire de multiplier le nombre de cellules par navire par le nombre total de navires. Pour déterminer le volume (ml) de suspension de cellules nécessaires pour inoculer chaque navire, divisez le nombre de cellules nécessaires pour inoculer un navire par le nombre de cellules viables / ml dans la suspension cellulaire. Si l'inoculation plus d'un navire de calculer le volume total de suspension cellulaire nécessaire en multipliant le volume nécessaire pour un navire par le nombre total de navires de se faire vacciner. </li><li> Centrifuger le volume souhaité de cellules dans un milieu basal agsNSC + 5% de FBS, laissant un lâche granulés. Normalement 500.000 cellules sont portées à un volume total de 25 ml dans le milieu basal agsNSC 5% de FBS, comme décrit précédemment. Aspirer le liquide et re-suspendre le culot dans lâches 10 ml de milieu Expansion agsNSC Cette étape de centrifugation supplémentaire est nécessaire pour éliminer FBS avant l'inoculation. Ajouter 10 ml de pré-chauffé moyen d'extension agsNSC le ballon T-75. Ajouter les 10 ml de suspension cellulaire en suspension dans le flacon T-75, puis ajouter 40 ul de rh FGF-base dans le ballon. Considérons que la trypsination et l'inoculation devrait pas prendre plus de 1,5 heures au moment de décider le nombre maximum de flacons de travailler avec à tout moment. On devrait aussi avoir assez de journalistes pour les changements de supports complète si vous utilisez des flacons nombreux. </li><li> Secouez doucement le ballon de côté à l'autre afin de répartir uniformément les cellules et les vaisseaux lieu de culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, comme décrit précédemment. </li></ol> 6. Dilution des cellules pour l'inoculation des plaques Eh bien pour la différenciation <ol><li> Toute multi-format et pourrait être utilisé, mais l'inoculation dans BD Biocoat poly-L-lysine revêtement des plaques de 96 puits est described ici. Déterminer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour votre expérience en multipliant le nombre de puits pour être inoculé par 0,2 ml par puits d'une 96 plaque multi-puits et ajouter environ 10% pour couvrir toute perte de volume lors de l'inoculation. Calculer la dilution à une densité cellulaire de 75 000 cellules / mL. Déterminer le montant de FBS à être ajouté au milieu de différenciation pour obtenir une concentration finale de 2% de FBS (tableau 1). Mélanger le FBS et milieu de différenciation. Mélanger délicatement les cellules avec le volume calculé de milieu de différenciation avec du FBS. (Note: Lors de la centrifugation les cellules basales sont en moyenne agsNSC + 5% SVF Bien FBS protège les cellules pendant la centrifugation et facilite l'adhésion des cellules inhibe FBS differention dilution à 2% de FBS permettra à l'adhérence des cellules à la surface multi-puits... Le FBS 2% est ensuite diluée pour promouvoir la différenciation. Insulin-transferrine-Sélénium (ITS-e) est également inclus dans le milieu de différenciation pour promouvoir la différenciation. </li><li> Dans une enceinte de biosécurité, de distribuer 200 uL de suspension cellulaire diluée à partir d'un réservoir Combitip stérile pour chaque puits d'une poly-L-lysine plaque de 96 puits revêtus à l'aide d'une pipette multi-canaux et des conseils grand orifice. Incuber les plaques pendant 1,5-2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Après que les cellules ont attaché, après environ 90 à 120 minutes, retirez soigneusement de 50% (100 ul pour plaques 96 puits) du milieu de chaque puits en utilisant de grands embouts de pipette orifice. Replacez soigneusement le volume enlevé avec milieu de différenciation chaude agsNSC, là encore en utilisant de grands embouts de pipette orifice. (Utilisation des conseils orifice normalisé peut blesser les cellules). </li><li> Deux jours après l'inoculation (~ 48 heures), effectuer un changement de milieu à 50% en utilisant milieu de différenciation agsNSC et grands embouts de pipette orifice. </li></ol> 7. Entretien des neurones <ol><li> Préparer le milieu d'entretien neuronale utilisant NeuraLife, la glutamine et B27 selon les instructions. Milieu d'entretien neuronale devrait être préparée par semaine. </li><li> Deux jours après le dernier changement de différenciation agsNSC moyen, normalement Jour 4 après l'inoculation, effectuer un remplacement moyen de 50% en utilisant un milieu d'entretien neuronale. </li><li> Continuer à effectuer des remplacements moyenne de 50% en utilisant un milieu d'entretien neuronale tous les 2 à 3 jours. Processus neuronaux devrait apparaître dans quelques jours du passage à un milieu d'entretien neuronale. Les cellules doivent être utilisées dans les 3 semaines d'être transférés à un milieu d'entretien neuronale. Les neurones peuvent être identifiés en utilisant un nombre de marqueurs neuronaux disponibles commercialement. Les astrocytes sera également toujours être observées. </li><li> Populations Culture expriment généralement un ratio supérieur à 40% des neurones au nombre total de cellules. L'utilisation des médias d'entretien des neurones autres que NeuraLife peut fournir des cellules inférieures qui ne regardent pas morphologiquement matures et peuvent ne pas survivre aussi longtemps dans la culture. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: L'Arctique spermophile cellules souches neurales adultes continuera à doubler tous les 24 heures pendant 3 à 5 jours pour au moins deux passages où ensemencées à 500,000-600,000 flacon cells/75mm. Ces cellules vont différencier facilement avec la suppression de basicFGF et B27 et la présence de FBS 1-2% et 1% insuline / Transferrine / sélénium, et deviendra TUJ1 (Covance) neurones positifs dans 14-21 jours (voir Figure 2). Le ratio des neurones aux cellules totale sera comprise entre 40-60%, dépendant de l'âge de la culture (figure 3). Les neurones peuvent être utilisés pour l'expérimentation de 12 jours après l'ensemencement à travers au moins 21 jours après le semis. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Microphotographie d'AGS pour adultes hippocampique cellules souches neurales. Photomicrographie phase de l'AGS pour adultes hippocampique cellules souches neurales suivante 3 jours de croissance dans les médias agsNSC basale en poly-L-ornithine flacons enduits. Doubler survient environ toutes les 24 heures. Photo à un grossissement de 100x. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Fluorescent micrographie différenciés AGS adulte hippocampique cellules souches neurales Cellules souches neurales AGS ont été soumis à des médias de différenciation pour 4 jours, puis maintenue dans Neuralife pour 17 jours de plus avant de fixer. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% et les neurones identifiés à l'aide TUJ1 anticorps primaire (Covance) et Alexa Fluor 568 anticorps secondaire (vert) d'Invitrogen. Colorant Hoechst 33343 a été ajouté pour colorer tous les noyaux (bleu). Le nombre de cellules, le nombre de neurones et le ratio de neurone ont été déterminés en utilisant le logiciel neurites et l'instrument de Arrayscan Cellomics. Cette photo représente environ 57% des neurones. Grossissement 10X <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Nombres de neurones et des cellules Ratio Neuron AGS différenciés souches neurales moins troisles âges de la culture Cellules souches neurales AGS ont été soumis à des médias de différenciation pour 4 jours, puis maintenue dans Neuralife pour les jours 12, 15 et 17 avant la fixation. Les cellules ont été fixées et les neurones identifiés avec TUJ1 anticorps primaire (Covance). Colorant Hoechst a été ajouté pour colorer tous les noyaux de cellules pour l'identification totale. Le nombre de cellules, le nombre de neurones et le ratio de neurone pour cent ont été déterminés en utilisant le logiciel neurites et l'instrument de Arrayscan Cellomics. Les valeurs représentent moyenne de 15 puits par condition + SD. Exemple de tableau des calculs 1. Utilisé dans repiquage et le semis <ol><li> Utiliser 700 000 cellules / ml de suspension cellulaire </li><li> En utilisant une densité cellulaire de 75 000 cellules / ml ou 15 000 cellules par puits de 0,2 ml de volume dans chaque puits. </li><li> Inoculation 96 puits à raison de 0,2 ml par puits = 19,2 mL ou désiré volume final 21 ml. </li><li> (Final Volume x concentration finale) ÷ concentration initiale = volume initial (21 ml x 75 000 cellules / mL) ÷ 700 000 = 2,25 mL </li><li> Volume de FBS en suspension de cellules. = 2,25 mL 2,25 mL x 0,05 = 0,1125 ml </li><li> Volume de FBS nécessaire dans 21 ml = 21 ml x 0,02 = 0,42 ml </li><li> Volume de FBS à ajouter à milieu de différenciation = 0,42 ml - 0,1125 0,3075 ml = ml </li><li> Le volume de milieu de différenciation = 21 ml - 2,25 ml de suspension cellulaire - 0,3075 ml 5% de FBS = 18,44 mL. </li><li> Combinez 18,44 milieu de différenciation mL avec 0.308 FBS ml et ajouter 2,25 ml de suspension cellulaire. </li></ol>

<ol><li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+avoidance+in+a+mammal%3A+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li>
<li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li>
<li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li>
<li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li>
<li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arctic+ground+squirrel+%28Spermophilus+parryii%29+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1%2F2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li>
<li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li>
<li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+progenitor+cells%3A+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li>
<li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li>
<li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li>
</ol>

Le juge Kelleher-Andersson est le fondateur de Neuronascent et est l&#39;inventeur sur les applications du sol arctique de brevets d&#39;écureuil. Neuronascent reçoit des redevances sur la vente d&#39;AGS médias et les cellules souches. RC McGee est employé par Lifeline, Inc, qui distribue des cellules médias et AGS souches neurales.

AGS cellules adultes souches neurales sont robustes et peuvent être étendues pour de nombreux passages qui en fait une excellente source de cellules souches neurales pour l&#39;étude de la base neurale propriétés de cellules souches. Le taux d&#39;expansion est d&#39;environ un doublement tous les vingt-quatre heures, mais ces cellules doivent être repiquées avant d&#39;atteindre la confluence, car le contact entre les cellules seront privilégier la différenciation d&#39;astrocytes. Contactez-médiatisée de différenciati...

<table><tbody><tr><td>agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de expansion agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0008</td><td>Source alternative pour DMEM/F12, B27 et rhFGFb (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Kit de différenciation agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0009</td><td>Source alternative pour DMEM/F12 et ITS-x (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Kit de milieu de maintenance NeuraLife</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0012</td><td>Les sources alternatives sont NeuraBasal (LifeLine) ou Neurobasal (Invitrogen), la glutamine et le B27 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;). Les cellules différenciées sont maintenues jusqu'à 3 semaines dans NeuroLife, mais pas plus de 2 semaines dans Neurobasal (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Micromètre (tel qu'une chambre de comptage Bright Line)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Plaques de 96 puits revêtues de poly-L-lysine Biocoat</td><td>BD Biosciences</td><td>356516</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Embouts de pipette à orifice large</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>Évite les dommages aux cellules neuronales lors de la pipetage. &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

croissance et différenciation des cellules adultes hippocampe arctic écureuil souches neurales au sol

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Les spermophiles arctiques (Urocitellus parryii, AGS) sont uniques dans leur capacité à hiberner avec une température corporelle de près ou en dessous de zéro 1. Ces animaux aussi résister à une lésion ischémique du cerveau in vivo 2,3 et de l&#39;oxygène du glucose in vitro, la privation 4,5. Ces qualités uniques ont donné l&#39;impulsion à isoler les neurones AGS afin d&#39;examiner les caractéristiques inhérentes neuronales qui pourraient rendre compte de la capacité des neurones à résister à l&#39;AGS blessures et la mort cellulaire provoquée par l&#39;ischémie et les températures extrêmement froides. Identifier ou protéines cibles de gènes qui permettent pour les propriétés distinctives de ces cellules pourrait aider à la découverte de thérapies efficaces pour un certain nombre d&#39;indications ischémiques et pour l&#39;étude de la tolérance au froid. Adulte AGS hippocampe contient des cellules souches neurales qui continuent à proliférer, ce qui permet une extension facile de ces cellules souches en culture. Nous décrivons ici les méthodes par lesquelles les chercheurs peuvent utiliser ces cellules souches et les neurones différenciés pour n&#39;importe quel nombre de buts. En suivant de près les étapes les cellules souches neurales AGS peut être étendu grâce à deux passages ou plus, puis différenciées pour une culture riche en TUJ1 neurones positifs (~ 50%) sans utiliser des produits chimiques toxiques afin de minimiser le nombre de cellules en division. L&#39;ischémie induit neurogenèse 6 et neurogenèse qui procède par MEK / ERK et voies de survie PI3K/Akt de signalisation contribue à la résistance d&#39;ischémie in vivo et in vitro 7 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., En préparation). Une caractérisation plus poussée de ces cellules uniques neurones peuvent avancer sur plusieurs fronts, en utilisant tout ou partie de ces méthodes.

Les cellules souches neurales ont été préparés à partir de l&#39;hippocampe d&#39;adultes non-hibernation yearlings spermophiles arctiques (AGS). Ces cellules souches neurales peuvent être complétés par de nombreux passages, différenciés et entretenu comme un neurone près 50:50 à la culture gliales.

Croissance et différenciation des cellules adultes hippocampe Arctic écureuil souches neurales au sol

Les écureuils terrestres de l'Arctique (Urocitellus parryii, AGS) sont uniques par leur capacité à hiberner avec une température corporelle centrale proche ou inférieure au point de congélation 1. Ces...

L'objectif général de cette procédure est de semer, amplifier et différencier des cellules souches neurales préparées à partir de l'hippocampe de jeunes écureuils terrestres arctiques adultes non hibernants. Cela est réalisé en premier lieu en semant les cellules souches neurales de l'AGS. Ensuite, amplifier et semer les cellules souches neurales dans un milieu de différenciation.La troisième étape de la procédure consiste à différencier et à maintenir les neurones, puis finalement, les cellules sont fixées ou traitées puis fixées pour analyse. En définitive, des résultats peuvent être obtenus montrant que les progéniteurs neuronaux GS continuent de se diviser pendant deux semaines de différenciation, de maintien, et même dans des conditions ischémiques. Le nombre de neurones est déterminé par des techniques de coloration et de microscopie fluorescente permettant de mesurer les rapports neuronaux.Les implications de cette technique s'étendent à la découverte de thérapies contre les accidents vasculaires cérébraux et l'arrêt cardiaque. Étant donné que les neurones différenciés de l'écureuil terrestre arctique tolèrent tous les traumatismes ischémiques, préparez le flacon destiné à l'expansion des A-G-S-N-S-C en le recouvrant de polyol ornithine avant de commencer cette procédure. Laissez la solution polyol ornithine en travail dans l'incubateur.Une fois décongelée, la solution peut être conservée jusqu'à un mois à une température de deux à huit degrés Celsius. Ajouter huit millilitres de solution working de polyol ornithine dans un flacon T 75 ventilé et répartir uniformément la solution sur toute la surface de culture du flacon. Incuber le flacon à 37 degrés Celsius pendant au moins 24 heures, de préférence dans un incubateur sans ajout de CO2 avant utilisation.Aspirez la solution polyol ornithine de travail du flacon et rincez deux fois avec du milieu de culture tissulaire stérile. Aspirez l'eau jusqu'à ce que le flacon soit presque sec avant de l'utiliser pour décongeler et semer les cellules souches neurales de l'écureuil terrestre arctique. Retirez d'abord un flacon de C-S-N-A-T-E de l'azote liquide et vérifiez que le bouchon du flacon est bien hermétiquement fermé.Tenez le haut du flacon tout en laissant sa moitié inférieure dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ 60 à 90 secondes. Gardez le bouchon du flacon hors de l'eau afin d'éviter toute contamination potentielle. Retirez le flacon du bain-marie lorsqu'il est presque complètement décongelé.Une petite quantité de glace doit encore être visible. Ne pas décongeler excessivement, car cela pourrait endommager les cellules. Vaporiser l'extérieur du flacon avec de l'éthanol à 70 % ou de l'isopropanol, puis transporter le flacon dans une cabine de sécurité biologique.Retirez soigneusement le bouchon afin d'éviter toute contamination ou éclaboussure. À l'aide d'une pipette stérile, ajoutez un millilitre de milieu basal dans le flacon et resuspendez délicatement.Suspendre les cellules. Transférer les cellules resuspendues dans 25 millilitres de milieu basal tiède dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger les cellules à 150 ×g pendant six minutes pendant que les cellules sédimentent.Ajoutez 10 millilitres de milieu d'expansion dans un flacon T 75 sec revêtu de poly-L-ornithine, puis ajoutez 40 microlitres de Rh FGF basique une fois la centrifugation terminée. Aspirez soigneusement le surnageant et le liquide sans aspirer le culot. Resuspendez les cellules dans 10 millilitres de milieu d'expansion.Transférez les cellules resuspendues dans le milieu du flacon T75. Secouez doucement le flacon de côté à côté pour répartir uniformément les cellules dans le récipient. Placez le flacon ensemencé dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Les cellules doivent s'attacher au flacon et commencer à former des prolongements dans les deux heures suivant leur semis, le jour suivant l'inoculation. Ajouter 40 microlitres de FGF basique Rh dans le flacon d'ASGNSC. Deux jours après le décongélation et le semis des cellules, effectuer un changement complet de milieu en utilisant 20 millilitres de milieu d'expansion additionné d'une supplémentation de 40 microlitres de FGF basique RH, le troisième ou le quatrième jour après l'inoculation.Le A-G-S-N-S-C doit être repiqué en aspirant le milieu du flacon T 75 et en ajoutant 2,5 millilitres de trypsine-EDTA ; agiter doucement pour garantir que toutes les cellules soient recouvertes de la trypsine. L'EDTA, puis tapoter délicatement le récipient de culture sur plusieurs côtés afin de favoriser le détachement. Une fois que les cellules se sont détachées, ajouter 10 millilitres de milieu basal au flacon et agiter doucement pour s'assurer que toute la solution de trypsine est neutralisée.Transférez les cellules à la pipette dans un tube stérile pour centrifugeuse contenant 10 millilitres de milieu basal. Ensuite, rincez le flacon avec 10 millilitres supplémentaires de milieu basal et mélangez avec le premier rinçage. Centrifugez les cellules à 150 ×g pendant six minutes. Après la centrifugation, les cellules doivent former un culot propre et lâche ; aspirez le surnageant du tube de centrifugation.Ensuite, à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, ajoutez 10 millilitres de milieu basal préchauffé et resus. Suspendez le culot cellulaire en pipetant doucement deux fois vers le haut et vers le bas. Si cette méthode est suivie rigoureusement, un rendement de trois divisions ou plus peut être attendu, produisant une population de plus de 4 millions de cellules à partir d’un nombre initial d’environ 500 000. Nous allons démontrer l’inoculation des A-G-S-N-S-C dans une plaque de 96 puits revêtue de poly-L-lysine pour la différenciation, bien qu’on puisse utiliser tout autre format de plaque multipuits pour cette procédure.Tout d'abord, déterminez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour votre expérience ainsi que la quantité de SBF à ajouter au milieu de différenciation A-G-S-N-S-C afin d'obtenir une concentration finale de 2 % de SBF. Un exemple de ces calculs est présenté ci-dessous dans le texte du protocole, à effectuer dans une hotte de sécurité biologique. Mélangez le SBF et le milieu de différenciation.Ensuite, mélanger soigneusement les cellules avec un volume calculé de milieu de différenciation contenant du FBS et transférer les cellules dans le milieu vers un réservoir stérile à embouts composites. À l’aide d’une pipette multicanal et d’embouts à orifice large, distribuer 200 microlitres de suspension cellulaire diluée depuis le réservoir dans chaque puits d’une plaque 96 puits revêtue de poly-L-lysine, puis incuber la plaque pendant une heure et demie à deux heures à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone, afin de permettre l’attachement des cellules. Le milieu.Le changement peut être une étape délicate de cette technique, car vous risquez d'endommager les cellules en utilisant des embouts de pipette de taille standard. Par conséquent, nous utilisons des embouts de pipette à large orifice afin de ne pas lésionner les cellules pendant le changement de milieu. Lorsque les cellules sont attachées, retirez soigneusement 50 %, soit 100 microlitres dans ce cas, du milieu de chaque puits à l’aide d’embouts de pipette à large orifice.Remplacer soigneusement le volume prélevé par du milieu de différenciation tiède, à l’aide de pipettes à embout large. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, deux jours après l’inoculation.Effectuez un changement à 50 % du milieu à l’aide de pipettes à embouts de moyenne et grande ouverture. Le milieu de maintenance neuronal, destiné à l’entretien des neurones, doit être préparé chaque semaine selon les instructions du fabricant. Deux jours après la dernière différenciation.Changement de milieu. Effectuez un remplacement de 50 % du milieu à l’aide du milieu de maintien neuronal. Retirez soigneusement 100 microlitres du milieu de différenciation de chaque puits à l’aide de pointes de pipette à large orifice et remplacez par 100 microlitres de milieu de maintien neuronal.Continuer à effectuer des remplacements de 50 % du milieu tous les deux à trois jours à l’aide du milieu de maintien neuronal. Les prolongements neuronaux devraient apparaître quelques jours après le passage au milieu de maintien neuronal. Les cellules doivent être utilisées dans les trois semaines suivant leur transfert dans le milieu de maintien neuronal.Souris grise arctique moyenne. Les cellules souches neuronales adultes doubleront toutes les 24 heures pendant trois à cinq jours pendant au moins deux passages lorsqu'elles sont ensemencées à raison de 500 000 à 600 000 cellules par flacon de 75 centimètres carrés. Cette microphotographie à 100 x montre des cellules souches neurales hippocampiques adultes GS après trois jours de croissance en A-G-S-N-S-C.Les milieux basaux dans des flacons revêtus de polyol-ornithine, ainsi que le FBS et le FGF basique RH, sont éliminés. Les cellules souches neurales A GS se différencieront en environ la moitié en neurones et en la moitié en astrocytes. Les neurones seront positifs pour T-tuj1 entre 14 et 21 jours, comme illustré par cette microphotographie en fluorescence.Ici, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %, et les neurones ont été identifiés en vert à l'aide d'un anticorps primaire TJ et d'un anticorps secondaire LOR 5 68. Tous les noyaux ont été colorés en bleu par l'ajout du colorant hooks die. Le ratio de neurones par rapport au nombre total de cellules variera entre 40 et 60 %, selon l'âge de la culture.Ce graphique montre le nombre de neurones et les rapports entre neurones ayant différencié à partir de cellules souches neurales GS à 16, 19 et 21 jours après l'inoculation. Pour la différenciation, les neurones peuvent être utilisés pour des expériences à partir de 12 jours après le semis jusqu'à au moins 21 jours après le semis. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des neurones de tamia arctique pour leur utilisation dans des expériences d'ischémie.

growth-differentiation-adult-hippocampal-arctic-ground-squirrel

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Cette vidéo démontre le processus de formation des neurosphères et leur expansion à partir du tissu hippocampique. Les cellules souches neurales et progénitrices du tissu gyrus denté de souris postnatale prolifèrent et forment des neurosphères primaires, qui sont ensuite réensemencées pour former des neurosphères secondaires.

Formation et expansion des neurosphères à partir d’un tissu hippocampique

Les cellules souches neurales récoltés dans le cerveau adulte sont de plus en plus utilisés dans des applications allant de la recherche fondamentale du développement du système nerveux à l'exploration des applications cliniques potentielles en médecine régénérative. Cela rend le contrôle rigoureux des conditions d'isolement et de culture utilisés pour cultiver ces cellules essentielles au son des résultats expérimentaux.

Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la production simultanée de cultures de cellules de précurseur de neurones, soit comme des monocouches ou des neurosphères adhérentes, à partir de la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de souris individuels adultes.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

Cet article vidéo illustre un protocole complet permettant de détecter et de quantifier tous les stades de la neurogenèse de l’hippocampe adulte au sein d’une même section de tissu. Nous avons élaboré une méthode pour surmonter les limites de l’immunofluorescence multiple indirecte qui surviennent lorsque des anticorps appropriés de différentes espèces hôtes ne sont pas disponibles.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Nous rapportons une méthode basée sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler les cellules souches neurales (NSC) et leur descendance de la zone sous-ventriculaire (SVZ) du cerveau de souris adulte. Appliqué aux souris transgéniques FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), il permet l’étude de la progression du cycle cellulaire par imagerie en direct.

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Le cerveau canin est un modèle précieux pour étudier la neurogenèse adulte. Présenté ici sont des protocoles d'isolement et de l'expansion des cellules adultes canines hippocampiques précurseurs neurales à partir de tissus du cerveau primaire.

Isolement et expansion des adultes Canine hippocampiques Neural Précurseurs

Le but de ce protocole est de décrire une approche pour analyser le comportement des cellules neurales adultes de tige/progéniteur en réponse à la manipulation chimiogénétique d'un circuit neural local spécifique.

Régulation spécifique du circuit d'analyse des cellules neuronales neuronales hippocampales adultes

Présenté ici est un protocole pour la génération spontanée de neurosphères enrichies dans les cellules progénitrices neurales des neurones plaqués de haute densité. Au cours de la même expérience, lorsque les neurones sont plaqués à une densité plus faible, le protocole entraîne également des cultures de neurones de rat primaire prolongées.

Génération de neurosphères à partir de neurones hippocampes et corticales primaires mixtes isolées de l'embryon de rat Sprague Dawley E14-E16

Dans cet article, nous décrivons, en détail, un protocole pour la génération des cultures de neurosphère à partir de cellules souches neurales de souris postnatales dérivées des principales niches neogènes de souris. Les neurosphères sont utilisées pour identifier les cellules souches neuronales à partir de tissus cérébraux permettant l’estimation du nombre de cellules précurseurs. En outre, ces structures 3D peuvent être plaquées dans des conditions différenciatives, donnant lieu à des...

Isolement et expansion des neurosphères des niches neurogéniques de souris postnatales (P1-3)

La transplantation de neurones GABAergiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines générées par la programmation neuronale pourrait être une approche thérapeutique potentielle pour les troubles neurodéveloppementaux. Ce protocole décrit la génération et la transplantation de précurseurs neuronaux GABAergiques dérivés de cellules souches humaines dans le cerveau de souris néonatales, permettant l’étude à long terme des neurones greffés et l’évaluation de leur potentiel thérapeutique.

Transplantation de neurones GABAergiques dérivés de cellules souches humaines dans l’hippocampe postnatal précoce de souris pour atténuer les troubles neurodéveloppementaux

Ici, nous décrivons un système de nucléofection conçu pour améliorer l’efficacité de l’administration de gènes dans les cellules souches neurales (NSC) élargies isolées de la zone sous-ventriculaire murine adulte. Les résultats démontrent que cette méthode améliore considérablement la perturbation des gènes dans les CSN, surpassant l’efficacité des protocoles de transfection traditionnels et augmentant le taux de survie cellulaire.

Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Découvrez la culture et la différenciation des cellules souches neurales du hippocampe d'écureuils arctiques adultes. Cette méthode permet d'obtenir des neurones et des cellules gliales pour étudier la neurogenèse et les effets ischémiques.

Croissance et différenciation des cellules adultes hippocampe Arctic écureuil souches neurales au sol

Explorer plus de vidéos