Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX

Bonjour, je suis Raja Ti et je fais mon doctorat à l’Institut du Cœur et du Diabète Baker IDI. Je vais vous expliquer les étapes de l’illustration 3D de la modification orientale qui a marqué les dommages à l’ADN et la condensation chromatique dans une nouvelle cellule cardiaque. L’ADN est enroulé autour des zones nucléaires.

Chaque nucléosome est composé de quatre types différents d’histones, H deux A, H deux b, H trois et H quatre radi. La formation de l’ADN se brise et cela est marqué par PHO de H deux X.Ce pho de H deux X se produit principalement dans la créatine qui est marquée par la méthylation de H trois K quatre. Nous allons maintenant examiner l’illustration 3D des modifications de votre immuno-marquage cellulaire avec la couche pho H deux X et la couche H méthylée Trois K quatre.

Commençons. Nous commençons par placer le parcours E de la suspension cellulaire dans 15 mil. Les tubes Falcon S sont lavés deux fois avec un parfum PB à un 50 G et Resus.

Suspendez-vous dans un milieu frais pour voir l’effet immédiat des radiations sur les événements cellulaires. Gardez les cellules sur les yeux pendant cinq à 10 minutes avant et pendant la radiothérapie. Exposez les cellules aux rayons gamma ou aux rayons X Après le rayonnement, versez trois millilitres de suspension cellulaire dans chaque GU de six.

Plaque de puits pour le pic gamma H deux X incuber les cellules entre 30 minutes et une heure à 37 degrés centigrades. Nous utilisons la mission Cytosine pour placer les cellules non adhérentes sur des lames de verre. Lors de l’assemblage du clip cytosine, assurez-vous que l’ensemble du cordon du filtre coïncide avec l’entonnoir.

Distribuez un tampon de 50 microlitres, tamponnez cette suspension cellulaire Dans chaque cytosine pour placer les clips de cytosine dans la mission de cytosine et faites-le tourner à 500 tr/min pendant cinq minutes. Retirez les clips de cytosine et séparez les lames de la carte filtrante. Ne laissez pas les cellules sécher trop longtemps à l’air libre, car cela pourrait influencer le bruit de fond de la coloration à la fluorescéine.

À l’aide d’une goupille bloquante de liquide, nous dessinons des cercles autour de chaque frottis, nous fixons les cellules avec 4 % de tête paraforme à température ambiante pendant cinq minutes. Par rapport à l’éthanol ou à l’ol, une meilleure fixation a été observée avec 4 % de tête paraforme. Glissières avec cellules perforées PPS avec Triton X 100 à température ambiante pendant cinq minutes.

Par rapport à twin 80, nous avons observé un meilleur signal dans les cellules avec Triton X 100. Regardez les cellules avec PP S3 fois chacune pendant cinq minutes. Bloquez les cellules chez une personne BSA pendant 10 minutes à température ambiante et répétez cette opération trois fois par rapport à d’autres agents bloquants et à des moments.

Pour minimiser la liaison non spécifique des anticorps primaires, nous avons utilisé deux anticorps primaires dilués un sur 500 avec 1 % de BSA à environ 50 microlitres d’anticorps primaires sur chaque lame. L’incubation de l’anticorps primaire à température ambiante pendant 60 minutes réduit les taches de fond par rapport à l’incubation de nuit à quatre degrés centigrades. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes.

Alexa étage 4 88, bon anti souris et Alexa étage 5 46 mots anti lapin. Des anticorps secondaires ont été utilisés pour maintenir différents marqueurs simultanément. Utilisez des anticorps élevés chez différentes espèces.

Ajoutez environ 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués à chaque lame. Incuber les cellules à température ambiante pendant 90 minutes. Il est recommandé d’incuber les cellules dans votre chambre humide car cela empêchera les cellules et les anticorps de sécher les lames de lavage avec PB S3 fois chacune pendant cinq minutes.

50 microlitres d’une dilution de un sur 500 de topo trois dans PBS ont été ajoutés à chaque lame. Lavez les lames avec du PBS trois fois chacune pendant cinq minutes. Retirez l’excès d’humidité des lames et ajoutez la solution Antifa.

Il est recommandé de ne pas assécher complètement les cellules avant d’ajouter la solution Antifa. Placez une lamelle sur la glissière. K doit être pris pour éviter la formation de bulles d’air.

Laissez les lames toute la nuit dans une chambre sombre et humide. Scellez la lame avec du vernis à ongles pour éviter le dessèchement des cellules. Les images acquises au microscope confocal révèlent.

Il n’y a pas de meilleure résolution spatiale et le laser à hélium a été utilisé pour l’acquisition d’images. Un objet à 63 émissions d’huile, deux lentilles préférées aux lentilles à grossissement supérieur ou inférieur. Un facteur de zoom de trois ou quatre produira une image de meilleure résolution.

Pour la comptabilité FO à partir de nombreuses cellules, il est préférable d’utiliser une vitesse de balayage de huit, une taille d’image de 1024 en cellules de 1024 pixels. Lors de l’imagerie de plusieurs canaux, une acquisition par balayage linéaire séquentiel est recommandée par rapport au balayage d’image. Pour éviter le blanchiment de l’échantillon, le gain du détecteur et le décalage de l’amplificateur sont ajustés pour réduire les souris et la saturation du signal.

Étant donné que la taille du Kama HX X four peut être inférieure à 0,5 micromètre, il est recommandé d’acquérir des images avec au moins 0,5 micromètre. Les images de pas le long de l’axe du jet sont requises dans un motif de série de jets utilisant le motif marquer en premier et marquer perdu. Pour illustrer la relation spatiale entre différentes protéines, il est recommandé d’utiliser une vitesse de balayage de six avec une taille d’image de 2048 et de 2 48 pixels en utilisant d’abord metamor.

La seconde peut être comptée à partir d’images acquises sur divers microscopes confocaux. Ouvrez les balises d’image gamma hgx directement à partir du menu Fichier ou à l’aide des numéros de facture. Étiquettes. Allez dans le menu Processus et choisissez Empiler l’arithmatique.

Choisissez la projection maximale et sélectionnez les plans à inclure. Et cliquez sur OK. Choisissez maintenant chapeau haut de forme et sélectionnez l’image Gamma H deux X comme image source à appliquer.

Le filtre chapeau et l’image résultante seront une image binaire avec moins de bruit et une variation réduite de l’intensité des foyers. Allez dans régions et sélectionnez l’outil de dessin de région et dessinez des régions autour des noyaux. Allez dans traiter, menu et image de seuil de vente.

Choisissez le seuil d’inclusion et définissez les valeurs de seuil inférieures et supérieures. Ce sont généralement les valeurs seuils qui affectent le nombre quatre. La valeur de seuil optimale est celle qui minimise l’inclusion de l’arrière-plan et maximise l’inclusion de l’incursion.

La meilleure façon d’y parvenir est de compter le nombre d’incursions à l’aide de différentes valeurs de seuil. Et puis comparez le nombre d’incursions avec le comptage à l’œil nu. Sélectionnez l’image DPI et allez dans le menu des régions, puis sélectionnez l’option de transfert des régions.

Nous avons maintenant des images d’incursion et nucléaires correspondantes prêtes à être comptées. La plupart des régions nucléaires sont transférées en chapeau haut-de-forme. Allez dans le menu Mesure et sélectionnez Analyse Arytique intégrée ou IMA, sélectionnez Mesurer toutes les régions et cliquez sur Mesurer pour obtenir le numéro ETP.

Désormais, les numéros ETP de chaque région peuvent être exportés dans une feuille de calcul à l’aide de l’option Enregistrer les données. Ouvrez les images de projecteur à jet précédemment créées pour chaque canal. Allez dans l’affichage et sélectionnez Alignement des couleurs.

Sélectionnez les images sources respectives pour chaque canal afin de créer une image pour les trois canaux. Une analyse linéaire est effectuée pour illustrer le positionnement spatial de différents marqueurs dans le noyau. Allez dans la commande des barres d’outils de mesure et sélectionnez l’analyse de balayage linéaire ligne sèche à travers la cellule.

Cela créera un graphique montrant l’intensité fluorescente de chaque canal le long de la ligne et représentera la distance des différents marqueurs les uns par rapport aux autres. Pour créer une image 3D à partir d’une pile, allez dans le menu Vers une pile et choisissez Reconstruction 3D. Sélectionnez le type de reconstruction 3D maximum.

Choisissez le plan de rotation, choisissez la distance d’étalonnage du jet. Habituellement, l’utilisateur spécifie cliquez d’accord pour créer une reconstruction 3D. Et cela conclut notre protocole pour l’immunofluor et la coloration et l’analyse d’images.

En résumé, le microscope confocal par immunofluorescence est une technique à deux pour la visualisation tridimensionnelle de différents marqueurs C et gamma H deux X foy dans le noyau cellulaire. Merci d’avoir regardé.