Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX
7 août 2010
L'analyse microscopique des γH2AX foyers, qui forment la suite de la phosphorylation de H2AX à Ser-139, en réponse à l'ADN des cassures double brin, est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous avons utilisé un anticorps mono-méthylé histone H3 lysine à 4 comme un marqueur épigénétique de la transcription euchromatine active, afin d'évaluer la distribution spatiale du rayonnement induit par la formation γH2AX au sein du noyau.
Bonjour, je suis Raja Ti, doctorant à l'Institut Baker IDI des maladies cardiaques et du diabète. Je vais vous guider à travers les étapes nécessaires à l'illustration en 3D de la modification d'Eastern montrant les lésions de l'ADN et la condensation chromatinienne dans une cellule cardiaque nouvelle. L'ADN est enroulé autour de nucléosomes.
Chaque nucléosome est composé de quatre types différents d'histones : H deux A, H deux b, H trois et H quatre radi. La formation de cassures de l'ADN est marquée par la phosphorylation de H deux X. Cette phosphorylation de H deux X se produit principalement dans la chromatine marquée par la méthylation de H trois K quatre. Nous allons maintenant examiner l'illustration en 3D des modifications dans votre cellule, immunomarquée avec la couche phospho de H deux X et la H trois K quatre méthylée.
Commençons. Nous commençons par placer le cours E de la suspension cellulaire dans des tubes Falcon de 15 ml. Les tubes sont lavés deux fois avec du PB, centrifugés à 150 g et resuspendus.
Suspendre dans un milieu frais pour observer l'effet immédiat du rayonnement sur les événements cellulaires. Garder les cellules sous observation pendant cinq à dix minutes avant et pendant l'irradiation. Exposer les cellules à un rayonnement gamma ou à des rayons X. Après l'irradiation, distribuer trois millilitres de la suspension cellulaire dans chaque unité de croissance parmi six.
Plaque de culture pour l'incubation des pics de gamma H2AX pendant 30 minutes à une heure à 37 degrés Celsius. Nous utilisons la mission CytoSpin pour déposer les cellules non adhérentes sur des lames en verre. Lors du montage du clip CytoSpin, veillez à ce que tout le cordon du filtre coïncide avec l'entonnoir.
Dispenser une suspension cellulaire de 50 microlitres dans chaque emplacement final de cytosine, puis insérer les supports de cytosine dans le dispositif Cytosine Mission et faire centrifuger à 500 tr/min pendant cinq minutes. Retirer les supports de cytosine et séparer les lames de la carte filtrante. Ne pas laisser les cellules sécher à l’air trop longtemps, car cela pourrait influencer le fond en coloration à la fluorescéine.
À l'aide d'un stylo hydrophobe, on trace des cercles autour de chaque frottis, puis on fixe les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % à température ambiante pendant cinq minutes. Par rapport à l'éthanol ou à l'ol, une meilleure fixation a été observée avec le paraformaldéhyde 4 %. Ensuite, on perméabilise les lames avec du Triton X-100 dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante.
Par rapport au double 80, nous avons observé un meilleur signal dans les cellules traitées avec du Triton X 100. Observer les cellules avec du PP S3 trois fois pendant cinq minutes chacune. Bloquer les cellules avec du BSA pendant 10 minutes à température ambiante et répéter cette étape trois fois, par comparaison avec d'autres agents et durées de blocage.
La BSA s'est révélée la plus efficace pour minimiser la liaison non spécifique des anticorps primaires ; nous avons utilisé deux anticorps primaires dilués au 1/500 dans 1 % de BSA, soit environ 50 microlitres d'anticorps primaire par lame. Une incubation de l'anticorps primaire à température ambiante pendant 60 minutes réduit la coloration de fond par rapport à une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Laver les cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes.
Alexa floor 4 88, bon anti-souris et Alexa floor 5 46 mot anti-lapin. Des anticorps secondaires ont été utilisés pour marquer simultanément différents marqueurs. Utilisez des anticorps produits chez des espèces différentes.
Ajoutez environ 50 microlitres d'anticorps secondaire dilué sur chaque lame. Incubez les cellules à température ambiante pendant 90 minutes. Il est recommandé d'incuber les cellules dans une chambre humide afin d'éviter le dessèchement des cellules et de l'anticorps. Lavez les lames avec du PBS trois fois, cinq minutes chacun.
50 microlitres d'une dilution au 1/500 de topo trois dans du PBS ont été ajoutés à chaque lame. Laver les lames avec du PBS trois fois, cinq minutes à chaque fois. Éliminer l'excès d'humidité des lames et ajouter la solution Antifa.
Il est recommandé de ne pas laisser sécher complètement les cellules avant d'ajouter la solution Antifa. Déposez une lamelle sur la préparation. Il convient de prendre soin d'éviter la formation de bulles d'air.
Laissez les lames toute la nuit dans une chambre humide et sombre. Scellez la lame avec du vernis à ongles pour éviter le dessèchement des cellules. Les images acquises sur un microscope confocal révèlent.
Une meilleure résolution spatiale est perdue et un laser à hélium a été utilisé pour l'acquisition des images. Un objectif à immersion huile de 63 est préféré aux objectifs de plus forte ou de plus faible grossissement. Un facteur de zoom de trois ou quatre permettra d'obtenir une image de meilleure résolution.
Pour la comptabilisation des FO à partir de nombreuses cellules, il est préférable d'utiliser une vitesse de balayage de huit et une taille d'image de 1024 sur 1024 pixels par cellule. Lors de l'acquisition d'images multicanaux, un balayage séquentiel par ligne est recommandé par rapport au balayage par trame. Afin d'éviter la décoloration de l'échantillon, le gain du détecteur et le décalage de l'amplificateur sont ajustés pour réduire le bruit et la saturation du signal.
Étant donné que la taille de Kama HX X four peut être inférieure à 0,5 micromètre, il est recommandé d'acquérir des images avec un pas d'au moins 0,5 micromètre. Des images dont le pas suit l'axe du jet sont nécessaires, organisées selon un motif de série de jets utilisant le motif « mark first » et « mark lost ». Pour illustrer la relation spatiale entre différentes protéines, il est recommandé d'utiliser une vitesse de balayage de six et une taille d'image de 2048 et 2 48 pixels à l'aide de Metamor first.
La seconde peut être décomptée à partir d'images acquises sur divers microscopes confocaux. Ouvrez les balises d'image gamma hgx soit directement depuis le menu fichier, soit en utilisant les numéros de facture. Allez dans le menu traitement et choisissez l'arithmétique de pile.
Choisissez la projection maximale et sélectionnez les plans à inclure. Puis cliquez sur OK. Sélectionnez maintenant le filtre top hat et choisissez l'image Gamma H2AX comme image source à appliquer.
Filtre en chapeau haut et image résultante seront une image binaire avec moins de bruit et une variation réduite de l'intensité des foyers. Accédez aux régions, sélectionnez l'outil de dessin de région et dessinez des régions autour des noyaux. Allez dans le menu Traitement et seuillez l'image.
Choisissez le seuil d'inclusion et définissez les valeurs de seuil inférieure et supérieure. Ce sont généralement les valeurs de seuil qui influencent les quatre nombres. La valeur de seuil optimale est celle qui minimise l'inclusion du fond et maximise l'inclusion de la zone d'intérêt.
Cela peut être obtenu de manière optimale en comptant le nombre de sorties à l'aide de différentes valeurs seuil, puis en comparant le nombre de sorties obtenu avec un comptage à l'œil nu. Sélectionnez l'image DPI et allez dans le menu des régions, puis choisissez l'option de transfert des régions.
Nous disposons désormais d'images correspondantes de forêts et de noyaux prêtes à être comptées. La plupart des régions nucléaires sont transférées au chapeau haut. Accédez au menu Mesurer et sélectionnez l'analyse intégrée des aires ou IMA, choisissez Mesurer toutes les régions, puis cliquez sur Mesurer pour obtenir le nombre FTE.
Les chiffres de ETP provenant de chaque région peuvent maintenant être exportés vers un tableur à l'aide de l'option de données de journalisation. Ouvrez les images du projecteur à jet créées précédemment pour chaque canal. Accédez à l'affichage et sélectionnez l'alignement des couleurs.
Sélectionnez les images sources respectives pour chaque canal afin de créer une image combinée pour les trois canaux. Une analyse par balayage linéaire est effectuée pour illustrer la position spatiale des différents marqueurs dans le noyau. Accédez à la commande des barres d'outils de mesure et sélectionnez l'analyse par balayage linéaire en traçant une ligne à travers la cellule.
Cela créera un graphique montrant l'intensité de fluorescence de chaque canal le long de la ligne et représentant la distance entre les différents marqueurs les uns par rapport aux autres. Pour créer une image 3D à partir d'une pile, allez dans le menu pile et choisissez la reconstruction 3D. Sélectionnez le type de reconstruction 3D : maximum.
Choisissez le plan de rotation, puis la distance d'étalonnage du jet. Habituellement, l'utilisateur spécifie et clique sur OK pour créer une reconstruction 3D. Et ce conclut notre protocole d'immunofluorescence, de coloration et d'analyse d'image.
En résumé, la microscopie confocale par immunofluorescence est une technique permettant la visualisation tridimensionnelle de différents marqueurs C et de la gamma H deux X foy dans le noyau cellulaire. Merci d'avoir regardé.
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Aperçu
Cette étude porte sur l'analyse des foyers γH2AX, qui sont des indicateurs essentiels des cassures double brin de l'ADN en biologie de la radiation. En utilisant un anticorps dirigé contre l'histone H3 mono-méthylée en lysine 4, la recherche évalue la distribution spatiale de la formation des γH2AX au sein du noyau après une exposition aux radiations.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie de la radiation
- Réponse aux dommages de l'ADN
- Épigénétique
Contexte
- La formation de foyers γH2AX est une réponse aux dommages de l'ADN.
- La phosphorylation de H2AX sur la sérine 139 est un marqueur clé.
- La mono-méthylation de l'histone H3 sur la lysine 4 indique une transcription active.
- La compréhension de la distribution spatiale des dommages de l'ADN est cruciale pour les études sur les radiations.
Objectif de l'étude
- Analyser la formation de foyers γH2AX en réponse aux radiations.
- Évaluer le rôle des marqueurs épigénétiques dans la réponse aux dommages de l'ADN.
- Visualiser la distribution spatiale de ces marqueurs au sein du noyau.
Méthodes utilisées
- Analyse microscopique des foyers de γH2AX.
- Utilisation d'anticorps pour la détection de l'histone H3 mono-méthylée.
- Techniques d'illustration 3D pour la visualisation des modifications nucléaires.
- Évaluation des effets induits par les radiations sur la structure de la chromatine.
Résultats principaux
- Identification des foyers γH2AX comme marqueurs des cassures double brin de l'ADN.
- Mise en évidence de la distribution spatiale de ces foyers dans le noyau.
- Corrélation entre les modifications des histones et l'activité transcriptionnelle.
- Aperçu du paysage épigénétique après une exposition aux radiations.
Conclusions
- Les foyers de γH2AX servent d'indicateurs efficaces des lésions de l'ADN.
- Les modifications des histones fournissent des informations précieuses sur l'état de la chromatine.
- L'étude améliore la compréhension de la réponse cellulaire au rayonnement.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La compréhension de la distribution spatiale de marqueurs de dommages de l'ADN tels que γH2AX fournit des éclairages mécanistiques sur le contexte de la chromatine et l'activité transcriptionnelle après une exposition aux radiations. Cette approche soutient la validation de cibles en reliant les états épigénétiques aux voies de réparation de l'ADN, permettant une confiance prédictive dans les modèles précliniques de stress génotoxique. La méthode améliore le développement de tests de dépistage de composés modulant les radiations en quantifiant la formation de foyers dans des compartiments nucléaires définis.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en corrélant les foyers γH2AX avec l'euchromatine active marquée par la méthylation de H3K4.
- Valeur opérationnelle : Permet la détection biologique des risques grâce à la résolution spatiale des lésions de l'ADN dans les régions chromatiniennes transcriptionnellement pertinentes.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en identifiant les composés modifiant les réponses aux dommages de l'ADN dépendantes de la chromatine.
Développement de criblage et de tests
- Préparation du test : Prépare des systèmes biologiques validés pour des criblages ultérieurs en standardisant la détection des foyers et leur co-localisation avec des marqueurs épigénétiques.
- Résultat quantitatif : Fournit des lectures reproductibles, basées sur l'imagerie, de la formation et de la distribution spatiale des foyers γH2AX dans les cellules non adhérentes.
- Pertinence pour le criblage : Permet une évaluation fiable des composés en facilitant une analyse à haut contenu des dommages de l'ADN dans des systèmes contextualisés au niveau de la chromatine.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie la détection précoce des lésions de l'ADN à la validation préclinique par l'alignement de biomarqueurs spécifiques à l'état de la chromatine.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Met l'accent sur la valeur prédictive en élucidant la manière dont l'activité transcriptionnelle influence la propagation de γH2AX après irradiation.
- Avancement ajusté au risque : Guide les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en révélant les différences de réparation des dommages entre l'euchromatine et l'hétérochromatine.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, en passant par l'évaluation préclinique, en particulier pour le criblage de composés génotoxiques et le suivi mécanistique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en révélant les profils spatiaux des lésions de l'ADN par rapport à l'activité transcriptionnelle.
- Écrantage : Améliore la reproductibilité des tests et la mesure quantitative des foyers pour l'évaluation de l'effet des composés.
- Analytique : Fournit des données intégrées sur l'intensité et la distribution spatiale, permettant l'analyse comparative entre conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique grâce à l'alignement de biomarqueurs épigénétiques dans les modèles de réponse aux radiations.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme d'imagerie et d'analyse réutilisable pour les études sur les lésions de l'ADN dans un contexte chromatinien.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique concernant la localisation des lésions de l'ADN.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité de la quantification des foyers et de l'analyse de leur co-localisation.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go), l'efficacité du capital et réduit les risques biologiques tardifs dans les programmes de génotoxicologie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque fondée sur les phénotypes de lésions et de réparation de l'ADN dépendants de la chromatine.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunofluorescence, en microscopie confocale et en détection de marqueurs épigénétiques.
- Dépend des instruments pour la reconstruction 3D, l'analyse par balayage linéaire et le traitement d'image basé sur un seuil.
- Exige une standardisation entre équipes pour la validation des anticorps, les paramètres d'imagerie et les protocoles de comptage des foyers.
- Implique des adaptations selon les types cellulaires, en particulier les modèles de cellules non adhérentes et primaires.
- Les limitations pratiques incluent la résolution du signal pour les foyers submicrométriques et l'éventuel photoblanchiment lors de l'acquisition multicanal.
