Name: Section du nerf optique: un modèle de lapoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Découvrez la section du nerf optique pour étudier l'apoptose neuronale chez l'adulte. Ce modèle reproductible permet d'analyser la mort cellulaire programmée des cellules ganglionnaires rétiniennes et d'explorer des stratégies neuroprotectrices.

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1. Technique chirurgicale <ol><li> Les expériences doivent être effectuées en utilisant une technique aseptique et en suivant les protocoles d'utilisation d'animaux de votre institution spécifique. Instruments et matériel (solutions, des substances d'essai, traceurs, aiguilles, etc) entrant en contact avec des tissus vivants doivent être stériles pour prévenir l'infection et les effets néfastes sur le bien-être animal et les impacts négatifs potentiels sur l'étude. </li></ol> 2. Anesthésie <ol><li> Les rats anesthésiés sera en utilisant un système de vaporisateur vétérinaire isoflurane. Utiliser l'oxygène de qualité médicale à un débit de 0,8 L / min pour vaporiser le gaz isoflurane. Placez l'animal dans la boîte ci-joint l'anesthésie et de composer dans une concentration d'isoflurane de 4% jusqu'à ce que la respiration s'est ralentie et l'animal est calme. </li><li> Ensuite, changer le débit de gaz à la fixation du masque à gaz pour cadre stéréotaxique et placer l'animal dans l'appareil de stéréotaxie. Tournez la concentration d'isoflurane à 2% et lun.anesthésie moniteur. Les plus gros animaux (&gt; 300 g) peut exiger une plus forte concentration d'isoflurane. L'anesthésie doit être surveillée pendant la chirurgie et la posologie ajustée en conséquence l'isoflurane. Profondeur et la vitesse de la respiration doit être constamment évaluée, et l'évaluation pincement de l'orteil (toutes les 5 min) pour l'absence de douleur profonde doit être effectuée. </li><li> Une fois que l'opération est terminée, éteignez l'isoflurane et permettre à l'animal à l'oxygène respiration pendant plusieurs minutes avant de le retirer de l'appareil stéréotaxique. La température du corps doit être maintenu en couvrant l'animal avec une couverture chirurgicale et / ou à l'aide d'une couverture chauffante régulée pendant la chirurgie. </li></ol> 3. Abord chirurgical <ol><li> Mouiller la fourrure sur le dessus de la tête avec de l'éthanol 70% pour rendre le plus facile à couper la fourrure. Enlever les poils d'entre les yeux à l'aide d'une tondeuse ou des ciseaux bien aiguisés. Nettoyez la zone d'incision à trois reprises avec des applications alternatives de solution détergente iode (Proviodine, bétadine, etc) followed par l'éthanol à 70%. Maintenir la cornée humide tout au long de l'opération en appliquant une pommade ophtalmique oeil (Tears Naturale PM) à la cornée. Propager la pommade sur la surface de la cornée par l'ouverture manuelle et de fermeture des paupières. </li><li> N ° 11 l'aide d'une lame, faire une incision le long de la ligne médiane de la tête d'environ 0,5 cm à l'avant des yeux à 1 cm derrière les yeux. Rétracter le lambeau de peau sur l'œil en utilisant une pince et doucement taquiner le mouchoir sous-jacente conjonctif avec le dos du scalpel. Ensuite, retirer le lambeau de peau latéralement et vers le bas et maintenez en place avec un écarteur chirurgical qui peut être collé sur la base de l'instrument stéréotaxique. </li><li> Faire une incision le long du bord supérieur de l'os orbital tout en tirant sur le fascia recouvrant avec des pinces acérées. Cela retirer le fascia l'orbite de l'œil. Le bord de l'os orbital peut être clairement délimitées à l'aide de pinces pour pousser vers le bas sur le fascia recouvrantl'orbite. L'utilisation d'un dispositif de cautérisation ou un scalpel, continuer l'incision en arrière vers la limite postérieure de l'orbite de l'œil. Utiliser l'os de l'orbite supérieure comme un guide pour l'incision. Suivant poursuivre les attaquants incision vers la limite antérieure de l'orbite. L'incision de l'orbite supérieure mieux est d'utiliser un dispositif de cautérisation de petite taille afin de prévenir l'hémorragie des vaisseaux sous-jacents qui communiquent avec les sinus veineux. </li><li> Si le saignement se produit plusieurs mesures peuvent être prises. Tout d'abord, appliquer une pression à l'aide des écouvillons stériles chirurgicaux ou des cotons-tiges. Si le saignement continue, appliquer du froid, une solution saline stérile de tampon phosphate (PBS) à la surface en utilisant un compte-gouttes, et maintenir la pression. Des saignements mineurs s'arrête après quelques secondes en utilisant cette procédure. Si le saignement persiste, appliquer une traction sur le tissu avec le tampon chirurgical ou coton-tige afin d'identifier la source du saignement et rapidement cautériser le vaisseau compromise. Après la saignée est contenu, utilisez stérile à froide PBS pour nettoyer la zone chirurgicale de sang. La zone chirurgicale doit être régulièrement nettoyé de cette façon afin de mieux visualiser les structures dans l'orbite de l'œil. </li><li> Une fois l'incision a été nettoyé, utiliser des forceps et le dos du scalpel pour nettoyer le tissu conjonctif à l'arrière de l'œil qui recouvre le contenu orbitales. L'arrière de la n ° 11 de scalpel fonctionne bien comme la pointe est fine. Cela permettra d'ouvrir des portions plus profondes de la cavité orbitaire fournissant une plus grande fenêtre chirurgicale pour travailler po utilisation Dumont # 7b arêtes dentelées pince courbée lorsque vous travaillez dans l'œil que leur courbure et pointes fines sont idéales pour manipuler les structures de l'orbite. En outre, les dentelures aider avec les structures de préhension. </li><li> Ensuite, retirez le tissu conjonctif qui entoure la division ophtalmique du nerf trijumeau, qui se trouve près de la ligne médiane, et enlever le nerf aide d'une pince. Cette étape n'est pas nécessaire, cependant enlever le nerf offrira une plus grande fenêtre d'accèss vers le nerf optique plus tard. </li><li> Après l'élimination du nerf, utilisez une pince pour retirer le vaisseau sanguin ci-dessous et complètement cautériser le vaisseau. Cette étape n'est pas non plus nécessaire, cependant cautérisation du navire lui permet d'être déplacé en avant, créant ainsi une plus grande fenêtre une fois que le nerf optique est atteint. </li><li> Utilisez une paire de pinces, forte ou une pince qui ont eu leurs conseils courbées vers l'intérieur à choisir soigneusement et enlever la mince couche de tissu conjonctif des muscles extra-oculaires et la glande lacrymale. Rentrez les muscles oculaires supplémentaires d'avant en arrière de l'orbite. Saisir la partie proximale du muscle avec une paire de pinces et en utilisant une deuxième paire de pinces dentelées courbes de pansements oculaires à exercer une traction vers l'extérieur sur le muscle. Faire en sorte que les pinces à pansement oculaire sont orientées dans la même direction que lors de l'extraction du muscle, afin d'éviter la déchirure. Retirer le muscle le plus antérieur de l'orbite (Superior oblique) de cette manière. Le muscle sera libéraliséATED au plus profond de l'orbite et la longueur restante peut être rétracté afin de faire tourner l'oeil vers l'extérieur. </li><li> Répétez l'étape 3.8 avec le muscle suivante (rectus médial) qui se trouve entre les lobes de la glande lacrymale et la glande de Harder près de la ligne médiane de la face dorsale de l'œil. Bande vers le bas l'enrouleur pour maintenir la traction sur les muscles. </li><li> Retirez doucement le tissu conjonctif restant sur la surface de la glande lacrymale et soulevez la glande vers le haut en utilisant une pince. Ne pas compresser ou de presser la glande. Pour rétracter la glande, seulement un seul récipient au pôle postérieur doit être cautérisé. Soulever l'extrémité postérieure de la glande vers le haut, et ensuite cautériser le vaisseau. </li><li> Ensuite, battre la glande lacrymale avant d'ouvrir la partie postérieure de l'orbite et de permettre un accès sans entrave aux muscles qui recouvrent le nerf optique. Gardez la zone humide en permanence à l'aide du PBS stérile et séchage avec des tampons chirurgicaux ou des cotons-tiges. </li><li> Utilisation sharpe Pince à nouveau enlever le tissu conjonctif qui entoure mince muscles de l'orbite postérieure (releveur paupière supérieure et droit supérieur) et de séparer les faisceaux de muscles sous-jacents. Rentrez les muscles indépendamment ou à l'unisson, à l'aide des pinces courbes dentelées pansements oculaires, encore une fois, en tirant dans le sens des fibres musculaires. Fixez les longueurs musculaires restantes à l'enrouleur avec les muscles qui ont été rachetées dans les étapes 3.8 et 3.9 et la bande vers le bas l'enrouleur pour appliquer une traction. Un total de 4 muscles vont maintenant être attaché à l'enrouleur. Cela fera tourner les yeux vers l'avant et vers l'extérieur dans le but de révéler la gaine contenant la graisse qui entoure le nerf optique. </li></ol> 4. Accès au nerf optique <ol><li> Utilisez une pince fine pointe pointus (Dumont) pour tirer vers le haut sur le tissu conjonctif qui entoure la gaine graisseuse du nerf optique. Faites une coupe longitudinale à l'aide de petits ciseaux à ressort Vannas. Développer la coupe si nécessaire. Thmatière grasse contenue e par la gaine va commencer à gonfler une fois la coupe terminée. Prochaine enlever les pans de tissu conjonctif en tirant avec précaution vers le haut à partir du bord coupant et les rabats de tissu en forme de croissant. </li><li> Retirez la graisse recouvrant le nerf optique à l'aide d'une pince pour tirer sur la graisse, tout en coupant avec des ciseaux à ressort Vannas. Garder la zone propre en utilisant du PBS stérile et tampons chirurgicaux pour nettoyer les petites quantités de sang qui découlent de l'ablation du tissu. </li><li> Le nerf optique est maintenant visible. Pour accéder au nerf, la gaine méningée qui entoure le nerf doit être enlevé sans endommager l'artère ophtalmique qui nourrit la rétine interne. Examinez le motif de la gaine vasculaire méningée aide d'une pince à tourner doucement la gaine. Recherchez une zone dépourvue de vaisseaux sanguins et en permettant une coupe longitudinale à faire dans la gaine méningée. </li><li> Utilisation pointe fine pince Dumont, pincer la dure-mère et tirer vers le haut. Près de la base ee coin triangulaire en forme de durée qui est créé, utilisez des ciseaux à ressort Vannas de faire une petite incision dans la gaine. Insérez la lame inférieure des ciseaux dans l'incision et couper la gaine parallèle à la direction du nerf optique, veillez à ne pas endommager le système vasculaire avec découpes latérales. Utiliser les pinces et des ciseaux à draper la durée de chaque côté du nerf optique. </li><li> La seule couverture restante du nerf est la membrane arachnoïde. Il est très mince et transparente. Afin de déterminer si la membrane est toujours présent, l'utilisation de pinces pointues pour pincer la surface du nerf. Il l'arachnoïde est présent, pincer la membrane et tirer vers le haut pour créer un coin triangulaire de tissu. Effectuer une petite incision avec la pointe des ciseaux similaires à l'étape 4,4. Ensuite, insérez la lame inférieure des ciseaux et faire une coupe longitudinale dans l'arachnoïde. Ensuite, utilisez vos ciseaux et des pinces à draper l'arachnoïde de chaque côté du nerf optique. </li><li> En utilisant un micro sur-gique crochet, élever le nerf optique de la gaine méningée. Passez la pointe du crochet autour du bord externe du nerf et assurez-vous que le crochet reste en contact avec le nerf de sorte que vous n'avez pas attraper les membranes méningées avec le crochet et accidentellement transect. Soulevez délicatement le nerf optique de la gaine méningée et complètement sectionner le nerf derrière le point pris en charge par le crochet. Le moignon du nerf sectionné optique auront désormais une extrémité libre, permettant le retrait de l'hameçon. </li><li> Si les CGR vont être marqués de façon rétrograde dans le but de quantifier la survie, placez un petit morceau de gelfoam trempé dans Fluorogold 3% (ou un autre traceur rétrograde) sur le moignon du nerf optique sectionné (voir <a href="https://www.jove.com/details.php?id=2261">JoVE protocole de 2261</a> ). </li></ol> 5. De clôture et de récupération <ol><li> Soulager la traction sur les muscles oculaires supplémentaires et retourner l'oeil à une position neutre. Ce faisant, assurez-vous que les to pousser le gelfoam vers le bas dans l'orbite de l'œil pour s'assurer que l'œil est tourné le remettre en place, le reste gelfoam autour du moignon du nerf optique. Retour la glande lacrymale et les muscles oculaires supplémentaires à leurs positions naturelles. </li><li> Retournez le lambeau de peau sur la ligne médiane et suturer la plaie. Appliquer une pommade ophtalmique à l'œil les deux yeux. Ensuite, éteignez la source de l'isoflurane et permettre à l'animal à l'oxygène respiration pendant plusieurs minutes. Placer l'animal dans une cage ou une cage chauffé sous une lampe chauffante à récupérer. Ne placez pas de linge de lit dans la cage de récupération pour éliminer le risque d'aspiration de literie lors de la récupération. </li><li> Les animaux doivent être logés de façon indépendante après la chirurgie. Analgésiques post-opératoire doit être administré selon les directives de votre administration de soins aux animaux, et les animaux doivent être surveillés attentivement après la chirurgie. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Transection des résultats du nerf optique dansla perte de 90% des CGR blessés dans les 14 jours postaxotomy 9-11. Le principal mécanisme de la mort RGC est l'apoptose 9, 12. La densité normale des CGR est d'environ 2500 cellules / mm 2. D'imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser CGR marqués de façon rétrograde après axotomie. RGC apoptose est retardé d'environ 4 jours après axotomie, en laissant une fenêtre de temps pour les manipulations expérimentales. Moins 1 jour après axotomie et marquage rétrograde avec Fluorogold, les corps cellulaires RGC dans la couche des cellules ganglionnaires de la rétine et fascicules axones dans la couche des fibres nerveuses de la rétine sont clairement visibles lorsque l'imagerie une préparation flatmounted (figure 1a). En 14 jours après axotomie, la majorité des CGR sont morts, et un CGR quelques autres sont intercalées entre la rétine microglie (figure 1b). Lorsque CGR apoptose, les microglies phagocytose des cellules mortes et, par conséquent deviennent transcellularly étiqueté avec le traceur fluorescent qui a été utilisé pour étiqueter le CGR 13, 14 &lt;/ Sup&gt;. L'apparition du traceur dans les phagosomes de cellules microgliales est différente de celle de CGR survivants. La microglie contenir le traceur dans les phagosomes très concentrés et très lumineux qui sont relativement grands et dispersés dans le cytoplasme (figure 1c). CGR ont un modèle plus diffuse de la coloration (figure 1c) avec ponctuées de petites vésicules qui ont été transportés par voie rétrograde vers le bas leurs axones classeurs cytoplasme de la cellule. Ces vésicules sont beaucoup plus petites et ont moins intense fluorescence permettant de différencier CGR survivants de la microglie. En outre, les microglies ont des corps cellulaires beaucoup plus petites et ont tendance à avoir une morphologie stellaire ou amiboïdes, par opposition à RGC qui ont un corps cellulaires relativement grandes et arrondies. Les arbres dendritiques de CGR peut aussi aider à les différencier des processus courts vives de la microglie, lors de la quantification survie cellulaire. La survie des cellules peut être quantifié dans les différentes régions de la rétine et de la densité (cellules / mm 2) peut être EXTRAPOLés de la zone des micrographies correspondantes, depuis RGC se trouvent dans une monocouche à l'intérieur de la couche des cellules ganglionnaires. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Micrographies épifluorescence de Fluorogold CGR marquées après axotomie et l'application du traceur sur le moignon du nerf optique. (A) 1 jour après axotomie CGR et leurs fascicules axones sont étiquetés avec le traceur d'une manière bien ponctuée. (B) En 14 jours après axotomie, 90% des CGR sont mortes et vives étiquetés microglies qui ont phagocyté les cellules mortes sont également marqués avec le traceur. (C) Grossissement supérieur montrant la différence entre CGR et la microglie (flèches rouges) à 14 postaxotomy jours. La barre d'échelle en A et B est de 50 um. La barre d'échelle en C est de 25 um.

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</ol>

Il existe de nombreuses variantes de cette intervention chirurgicale et plusieurs des étapes de ce protocole ne sont pas nécessaires. Il est seulement nécessaire de rétracter les muscles qui recouvrent le nerf optique, afin d&#39;avoir accès au nerf. Toutefois, cela se traduit par un espace très limité de travail autour du nerf rendant les phases critiques finales de transection plus difficile. Dans certaines situations, il est souhaitable de transfecter les cellules de la souche du nerf optique et l&#39;espace d&#39;ac...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Cadre stéréotaxique </td><td></td><td> Stoelting, Kopf, WPI </td><td></td><td></td><tr><td> Masque à gaz Rat </td><td></td><td> Stoelting, Kopf, WPI </td><td></td><td></td><tr><td> Système d&#39;anesthésie </td><td></td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td><tr><td> L&#39;isoflurane (Pr AErrane) </td><td></td><td> Baxter Corp </td><td> DIN 02225875 </td><td></td><tr><td> Microscope chirurgical </td><td></td><td> WPI, Zeiss, Leica </td><td></td><td></td><tr><td> Fluorogold - (Hydroxystilbamidine bis (methanesulfonate) </td><td></td><td> Sigma </td><td> 39286 </td><td></td><tr><td> Gelfoam </td><td></td><td> Pharmacia &amp; Upjohn </td><td></td><td></td><tr><td> Tears Naturale PM </td><td></td><td> Alcon </td><td></td><td></td><tr><td> Proviodine </td><td></td><td> Medline </td><td> MDS093945H </td><td></td><tr><td> Vannas ciseaux à ressort </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-00 </td><td></td><tr><td> Pointe fine pince Dumont </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-00 </td><td></td><tr><td> Micro crochet chirurgical </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 10062-12 </td><td></td><tr><td> Eye pansement dentelé pince </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 11152-10 </td><td></td><tr><td> Dumont # 7b forte courbe en dents de scie pince </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 11270-20 </td><td></td><tr><td> Cauterizer </td><td></td&gt; <td> Outils Fine Science </td><td> 18010-00 </td><td></td></tbody></table></div>

section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) sont des neurones du système nerveux central que l&#39;information de sortie visuelle de la rétine au cerveau, via le nerf optique. Le nerf optique peut être consulté dans l&#39;orbite de l&#39;oeil et complètement sectionné (axotomisés), couper les axones de toute la population RGC. Section du nerf optique est un modèle reproductible de la mort cellulaire par apoptose neuronale dans le SNC adulte 1-4. Ce modèle est particulièrement intéressant car la chambre vitrée de l&#39;œil agit comme une capsule pour l&#39;administration de médicaments à la rétine, ce qui permet des manipulations expérimentales par des injections intraoculaires. La diffusion de produits chimiques dans le corps vitré assure qu&#39;ils se fondent sur l&#39;ensemble de la population RGC. En outre, RGC peut être sélectivement transfectées par l&#39;application de courtes ARN interférents (ARNsi), des plasmides ou des vecteurs viraux, de l&#39;extrémité coupée des vecteurs du nerf optique ou 5-7 injecter dans leur cible, le colliculus supérieur 8. Cela permet aux chercheurs d&#39;étudiermécanismes apoptotiques dans la population neuronale souhaitée sans effets confondants sur les neurones ou des cellules gliales autres spectateurs environnant. Un autre avantage est la facilité et la précision avec laquelle la survie des cellules peut être quantifié après une blessure. La rétine est un plat, tissu couches et CGR sont localisés dans la couche la plus profonde, la couche des cellules ganglionnaires. La survie des RGC peut être suivie dans le temps par l&#39;application d&#39;un traceur fluorescent (3% Fluorogold) à l&#39;extrémité coupée du nerf optique au moment de l&#39;axotomie, ou par injection du traceur dans le colliculus supérieur (cible RGC) une semaine avant l&#39; axotomie. Le traceur est transporté par voie rétrograde, l&#39;étiquetage de toute la population RGC. Parce que la couche des cellules ganglionnaires est une monocouche (une cellule d&#39;épaisseur), la densité du CJR peuvent être quantifiés dans le tissu plat monté, sans la nécessité d&#39;stéréologie. Section du nerf optique conduit à la mort par apoptose de 90% des CGR blessés dans les 14 jours postaxotomy 9-11. Apoptose RGC a une caractéristique temps-cours whereby mort cellulaire est retardé 3-4 postaxotomy jours, après quoi les cellules dégénèrent rapidement. Ceci permet d&#39;obtenir une fenêtre de temps pour les manipulations expérimentales dirigés contre les voies de l&#39;apoptose.

Section du nerf optique est un modèle largement utilisé de lésion du SNC adulte. Quatre-vingt dix pour cent des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) dont les axones sont complètement sectionné (axotomie) meurent dans les 14 jours après axotomie. Ce modèle est facilement prêter à des manipulations expérimentales et hautement reproductibles.

Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont des neurones du SNC qui transmettent les informations visuelles de la rétine vers le cerveau, via le nerf optique. 
Le nerf optique peut être...

Les cellules ganglionnaires rétiniennes, ou C.G.R., sont des neurones du système nerveux central qui transmettent l'information visuelle de la rétine au cerveau par le biais du nerf optique. La section du nerf optique constitue un modèle reproductible de mort cellulaire neuronale apoptotique dans le système nerveux central adulte. Ici, la section du nerf optique est réalisée en ouvrant l'orbite supérieure de l'œil, permettant ainsi d'accéder aux structures qui recouvrent le nerf optique.La glande lacrymale et les muscles extraoculaires sont rétractés, puis les gaines méningées du nerf optique sont ouvertes. Le nerf optique est ensuite soulevé hors de ses gaines méningées et sectionné. En fin de compte, 90 % des cellules ganglionnaires rétiniennes lésées, dont les axones constituent le nerf optique, meurent par mort cellulaire programmée dans les deux semaines suivant la lésion.Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres modèles de lésions cérébrales est que la transection du nerf optique est plus reproductible et que les neurones lésés peuvent être ciblés plus facilement par des manipulations expérimentales. Les implications de cette technique s'étendent aux thérapies des lésions et maladies du système nerveux central, car la rétine neurosensorielle fait partie du système nerveux central adulte. La démonstration de cette procédure sera effectuée par Philippe Donofrio et Mark Magus à destination d'étudiants de master de mon laboratoire.Commencez cette procédure en plaçant un rat dans la chambre d'anesthésie et en réglant une concentration d'isoflurane à 4 %. Une fois que la respiration de l'animal s'est ralentie, basculez le flux de gaz vers l'embout masque facial du cadre stéréotaxique et placez l'animal dans l'appareil stéréotaxique. Réduisez ensuite la concentration d'isoflurane à 2 %. Placez le cône nasal et surveillez l'anesthésie. Humidifiez le pelage sur le dessus de la tête avec de l'éthanol à 70 % pour faciliter la coupe du pelage.Ensuite, à l’aide d’un tondeur, raser le pelage situé entre les yeux en utilisant des compresses stériles en gaze. Nettoyer la zone d’incision par trois applications alternées de Bétadine, suivies d’éthanol à 70 %. Puis, appliquer un onguent ophtalmique sur la cornée afin d’éviter qu’elle ne s’assèche pendant l’intervention chirurgicale, et répartir l’onguent sur la surface en ouvrant et fermant les paupières.À l’aide d’un bistouri n°11, pratiquez une incision le long de la ligne médiane de la tête, depuis environ 0,5 centimètre en avant des yeux jusqu’à un centimètre en arrière des yeux. À l’aide de pinces, rétractez le lambeau de peau au-dessus de l’œil. Utilisez l’arrière du scalpel pour détacher délicatement le tissu conjonctif sous-jacent et libérer la peau recouvrante.Ensuite, rétracter latéralement et vers le bas le lambeau de peau et le maintenir en place à l’aide d’un rétracteur chirurgical. Fixer le rétracteur avec du ruban adhésif à la base de l’instrument stéréotaxique tout en tirant sur le fascia sus-jacent à l’aide de pinces fines, puis pratiquer une incision le long du bord supérieur de l’os orbital. Cela permet de dégager le fascia recouvrant l’orbite de l’œil.Utilisez une pince pour appuyer sur la fascia recouvrant l'orbite, puis, à l'aide d'un petit dispositif de cautérisation, délimitez clairement le rebord de l'os orbital. L'utilisation du dispositif de cautérisation permettra d'éviter les saignements provenant des vaisseaux sous-jacents qui communiquent avec les sinus veineux. Utilisez du PBS froid et stérile pour nettoyer la zone chirurgicale de tout sang.La zone chirurgicale doit être nettoyée périodiquement de cette manière afin de permettre une meilleure visualisation des structures de l'orbite oculaire. Une fois l'incision nettoyée, utilisez une pince et le dos du scalpel pour retirer le tissu conjonctif situé à l'arrière de l'œil, qui recouvre les contenus orbitaires. Cela permettra d'ouvrir la cavité orbitaire, offrant ainsi une fenêtre chirurgicale plus large pour l'intervention.Ensuite, à l’aide d’une pince courbe à dents de type Dumont numéro sept B, retirez le tissu conjonctif entourant la division ophtalmique du nerf trijumeau, située près de la ligne médiane, puis retirez le nerf à l’aide de la pince. Bien que cette étape ne soit pas indispensable, l’ablation du nerf permettra par la suite un accès élargi au nerf optique après son retrait. Utilisez la pince pour rétracter le vaisseau sanguin situé en dessous et cautérisez complètement le vaisseau.Cette étape n'est pas non plus nécessaire, toutefois, la cautérisation du vaisseau permet de le déplacer vers l'avant, créant ainsi une fenêtre plus grande. Une fois le nerf optique atteint, utilisez une paire de forceps dont la pointe a été incurvée vers l'intérieur afin de prélever soigneusement et d'éliminer la fine couche de tissu conjonctif recouvrant les muscles extraoculaires et la glande lacrymale.Retracter les muscles extraoculaires de l'avant vers l'arrière de l'orbite. Saisir la partie proximale du muscle avec une paire de forceps et utiliser une deuxième paire de forceps courbes à dents, orientée dans le même sens que le muscle, afin d'appliquer une traction vers l'extérieur. Enlever le muscle le plus antérieur de l'orbite, le muscle oblique supérieur.Encore une fois, en utilisant la même technique, retirez le droit médial situé entre les lobes de la glande lacrymale et la glande dure près de la ligne médiane de la surface dorsale de l'œil. À l’aide de pinces, retirez délicatement tout tissu conjonctif restant à la surface de la glande lacrymale et soulevez la glande vers le haut. N’écrasez ni ne comprimez la glande pour la rétracter.Soulevez l'extrémité postérieure de la glande vers le haut, puis cautérisez le vaisseau au pôle postérieur. Ensuite, rabattez la glande lacrymale vers l'avant afin d'ouvrir la partie postérieure de l'orbite, permettant un accès sans entrave aux muscles recouvrant le nerf optique. Appliquez à nouveau du PBS stérile pour maintenir la zone humide et nettoyez tout sang à l’aide de compresses chirurgicales et de pinces fines.Une fois encore, retirez le tissu conjonctif mince qui entoure les muscles de l'orbite postérieure et séparez les faisceaux musculaires sous-jacents à l'aide de la pince à pansement oculaire crantée courbe. Tirez dans l'axe des fibres musculaires pour rétracter les muscles séparément ou simultanément. Enfin, fixez l'objectif musculaire restant au rétracteur, ainsi que les muscles rétractés, puis fixez le rétracteur avec du ruban adhésif afin d'appliquer une traction.Cela permettra de faire pivoter l’œil vers l’avant et vers l’extérieur afin de révéler la gaine contenant la graisse qui entoure le nerf optique. À l’aide d’une pince Dumont à pointe fine, tirer vers le haut sur le tissu conjonctif qui recouvre la gaine grasse du nerf optique en utilisant des ciseaux à ressorts veineux de petite taille. Effectuer une incision longitudinale.Agrandissez l'incision selon les besoins. La graisse contenue dans la gaine commencera à s'arrondir. Ensuite, tirez délicatement vers le haut à partir du bord et découpez les lamelles en forme de croissant en utilisant une pince pour tirer sur la graisse.Coupez la graisse recouvrant le nerf optique à l’aide des ciseaux à ressort de Venise. Nettoyez, à l’aide de PBS stérile et de compresses chirurgicales, les petites quantités de sang provenant de l’ablation du tissu. Le nerf optique est désormais visible et accessible.La gaine méningée qui entoure le nerf doit être retirée sans endommager l'artère ophtalmique, qui vascularise la rétine interne. En utilisant des pinces pour la faire doucement tourner, examiner le schéma vasculaire de la gaine méningée à l’aide de pinces Dumont à pointe fine. Pincer la dure-mère et tirer vers le haut, formant ainsi un triangle en forme de coin près de la base du nerf.Utilisez les ciseaux pour pratiquer une petite incision longitudinale dans la gaine méningée, en prenant soin de ne pas endommager le système vasculaire. Insérez la lame inférieure des ciseaux dans l'incision et coupez la gaine parallèlement à la direction du nerf optique.Utilisez la pince et les ciseaux pour écarter la dure-mère de chaque côté du nerf optique. Le seul revêtement restant du nerf est la fine membrane arachnoïdienne transparente. Pour déterminer si la membrane est encore présente, utilisez une pince fine pour pincer la surface du nerf et tirez vers l'extérieur. Si les revêtements méningés sont encore présents, ils seront visibles.Si l'arachnoïde est présente, pincer la membrane et tirer vers le haut. Pour créer un triangle de tissu, pratiquer une petite incision avec la pointe des ciseaux. Puis insérer la lame inférieure des ciseaux et effectuer une incision longitudinale dans l'arachnoïde.Ensuite, utilisez des ciseaux et une pince pour écarter l’arachnoïde de chaque côté du nerf optique. À l’aide d’un crochet de chirurgie microchirurgicale, soulevez le nerf optique hors de sa gaine méningée. Passez la pointe du crochet autour du bord externe du nerf et veillez à ce que le crochet reste en contact avec le nerf.Évitez de saisir les membranes méningées avec le crochet et de les sectionner accidentellement. Soulevez délicatement le nerf optique de sa gaine méningée et sectionnez complètement le nerf en arrière du point soutenu par le crochet. Le moignon de nerf optique sectionné présentera désormais une extrémité libre.Retirez le crochet si les cellules ganglionnaires de la rétine doivent être marquées de façon rétrograde. Afin de quantifier la survie, placez un petit morceau de gel-foam imbibé de 3 % de fluoro or ou d'un autre traceur rétrograde sur le moignon du nerf optique sectionné. Relâchez la traction exercée sur les muscles extraoculaires et appliquez une pression sur la surface oculaire supérieure en direction de la ligne médiane pour ramener l'œil en position neutre.En même temps, enfoncer doucement le gel dans l’orbite de l’œil. Cela garantit que l’œil est réinséré en position et que le gelfoam reste autour du moignon du nerf optique. Remettre la glande lacrymale et les muscles extraoculaires à leur place naturelle, ramener le lambeau de peau vers la ligne médiane et suturer la plaie.Appliquer un onguent ophtalmique sur les deux yeux. Une fois la chirurgie terminée, éteindre l'isoflurane et laisser l'animal respirer de l'oxygène pendant plusieurs minutes. Retirer l'animal du dispositif stéréotaxique.Placer l'animal dans une cage sous une lampe chauffante pour qu'il se remette, afin d'éliminer le risque que le rat inhale des copeaux pendant la récupération. S'assurer qu'il n'y a pas de litière dans la cage de récupération. Administrer des analgésiques postopératoires.Conformément aux directives institutionnelles, surveiller attentivement l'animal après la chirurgie. La section du nerf optique entraîne la perte de 90 % des CBR lésés dans les 14 jours suivant la névrotomie. Le mécanisme principal de la mort des CBR est l'apoptose.La densité normale des cellules ganglionnaires rétiniennes est d'environ 2 500 cellules par millimètre carré. L'imagerie en épifluorescence ou confocale peut être utilisée pour visualiser les cellules ganglionnaires rétiniennes marquées de façon rétrograde. Après taxotomie.L'apoptose des CBR est retardée d'environ quatre jours après la section du nerf optique, laissant une fenêtre temporelle pour des manipulations expérimentales un jour après la section du nerf optique et le marquage rétrograde avec Flora Gold. Les corps cellulaires des CBR dans la couche ganglionnaire de la rétine et les faisceaux d'axones dans la couche des fibres nerveuses de la rétine sont clairement visibles. Lors de l'observation d'une préparation en montage plat 14 jours après la section du nerf optique, la majorité des CBR ont disparu et quelques cellules résiduelles sont disséminées parmi les microglies rétiniennes. Lorsque les CBR subissent une apoptose, les microglies phagocytent les cellules mortes et deviennent ainsi marquées de manière cellulaire par un traceur fluorescent qui avait été utilisé pour marquer les CBR, comme indiqué ici par les flèches rouges.L'apparition du traceur dans les phagosomes des microglies est différente de celle observée dans les CBR survivantes. Les microglies contiennent le traceur dans des phagosomes très concentrés, extrêmement brillants, relativement volumineux et dispersés dans tout leur cytoplasme. Les CBR présentent un motif de coloration plus diffus, avec de petites vésicules ponctuées qui ont été transportées de façon rétrograde le long de leurs axones, remplissant ainsi le cytoplasme cellulaire.Ces vésicules indiquées par les flèches blanches sont beaucoup plus petites et présentent une fluorescence moins intense, permettant ainsi de distinguer les cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) survivantes des microglies. De plus, les microglies ont des corps cellulaires nettement plus petits et tendent à présenter une morphologie ramifiée ou amiboïde, contrairement aux RGC qui possèdent des corps cellulaires relativement grands et arrondis. Une fois masquées, cette technique peut être réalisée avec succès en 15 minutes si elle est correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'éviter tout dommage à l'irrigation sanguine rétinienne, car la rétine dégénérera si la vascularisation est compromise après cette intervention.D'autres méthodes, telles que les injections intraoculaires ou les injections dans le moignon du nerf optique sectionné, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quelles sont les mécanismes impliqués dans l'apoptose des cellules ganglionnaires de la rétine.

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