Name: Limagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Découvrez une méthode d'anesthésie au desflurane pour l'imagerie in vivo de larves de Drosophila melanogaster à haute résolution. Ce protocole permet d'étudier la dynamique synaptique sur plusieurs jours avec un taux de survie de 95%.

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Nous remercions Andreas Schönle, Max-Planck-Institut de chimie biophysique, l&#39;Allemagne et David J. Sandstrom, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Etats-Unis pour des conseils techniques. Nous tenons à remercier Frank Kötting, European Neuroscience Institute, Göttingen pour la construction de la chambre de l&#39;imagerie et l&#39;appareil anesthésie. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Initiative d&#39;Alzheimer Forschung à TMRYZ a été soutenue par une bourse du Conseil des bourses de Chine, le SBH par une bourse de la Graduate School pour les Neurosciences cellulaires et moléculaires, Université de Tübingen.

A) de l'Assemblée de la chambre de l'imagerie <ol><li> Sélectionnez une larve du stade choisi (par exemple au début 3 ème stade larvaire en laissant un intervalle d'observation d'environ 24 heures à 25 ° C jusqu'à errance scène). </li><li> Rincer la larve à l'eau pour le nettoyer du milieu de culture et de la limande sécher. </li><li> Enduire le centre de l'élément de fond de la chambre, dans la région pour faire face à la larve, avec un mince film d'huile sur les halocarbures. </li><li> Mettez la larve avec la face ventrale face à l'objectif du microscope dans la chambre (permet jonction neuromusculaire (JNM) 26 et 27 à imager) (figure 1 AE). </li><li> Placer l'entretoise en plastique sur la couche d'huile, avec les fentes d'air de la face vers le haut de grille (Figure 1). S'il vous plaît vérifier à cette étape: La hauteur de la cale est à peu près la moitié du diamètre des larves, la largeur de la fente doit être environ deux fois le diamètre de la larve. </li><li> Placez la chambre d'imagerie sur le microscope </li></ol> B) Anesthésie de la larve <ol start="7"><li> Relier les deux entrées de la chambre avec une anesthésie appropriée périphérique / vaporisateur. S'il vous plaît vérifier à l'avance: La concentration efficace de desflurane dans la salle de l'air ne devrait jamais dépasser celle spécifiée par les règlements de sécurité! Seul un très petit volume total de desflurane est nécessaire pour anesthésier les larves. L'application de 15% (v / v) d'une desflurane s'est avéré être un bon point de départ pour déterminer la concentration idéale pour être utilisée dans une expérience. Pour des raisons de sécurité nous suggérons que le vaporisateur ne devrait jamais contenir plus que nécessaire desflurane pour 2-4 heures de l'imagerie in vivo. </li><li> Immerger l'autre extrémité du tube fixé à la sortie de la chambre dans un verre d'eau, puis ouvrir les vannes de régulation du débit de l'anesthésique dans la chambre pendant environ cinq secondes. S'il vous plaît vérifier à cette étape: Ne bulles d'air montent dans l'eau? Si ce n'est pas la chambre est percé. </li><li> Fermer les vannes pendant environ trois secondes. </li><li> Surveiller les mouvements résiduels de larves dans le microscope. Vérifiez la fois le rythme cardiaque et les mouvements musculaires. Si nécessaire soupapes s'ouvrent et se ferment comme décrit dans l'étape 8 et 9 jusqu'à ce que l'anesthésie de la larve est terminée, puis fermez tous les robinets et commencer l'imagerie. S'il vous plaît vérifier à cette étape: Mouvements musculaires résiduelles ou pouls indique que la larve n'est pas correctement anesthésié. Anesthésie complète est vitale pour des images haute résolution. La larve ne devrait normalement pas être anesthésiés pendant plus de 15-20 minutes à une heure donnée. </li></ol> C) Imagerie <ol start="11"><li> Identifier la position correcte et l'image de la structure d'intérêt (figure 2-4). </li></ol> D) La récupération d'une anesthésie <ol start="12"><li> Après l'imagerie est terminée laisser entrer l'air dans la chambre. S'il vous plaît vérifier à cette étape: Vérifiez les contractions musculaires et des battements de cœur de la larve par une lumière halogène transmis. Comme les muscles commencent traitance qu'il est sécuritaire d'enlever la larve de la chambre de l'imagerie. </li><li> Détachez la chambre de l'appareil anesthésie et de le retirer du microscope. Démonter la chambre avec soin et placez la larve dans un milieu de culture de volée écrasée. </li><li> Rangez la vaisselle dans un incubateur à la température appropriée. </li></ol> Séries E) <ol start="15"><li> Répétez la procédure jusqu'à 2-14 points de temps suffisantes ont été obtenues. Alternative protocole: Si la larve est à imager plus d'une fois dans un intervalle de 30 minutes il peut être pratique de le laisser dans la chambre d'imagerie jusqu'au point de temps anesthésie prochaine. Répétez la procédure jusqu'à 7-14 points de temps suffisantes ont été obtenues. S'il vous plaît vérifier à cette étape: La larve est de ne pas être conservé dans la chambre de l'imagerie depuis plus de deux heures à la fois, ni d'être anesthésiés pendant plus de 15-20 minutes à une heure. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> La figure 1 de l'Assemblée de la chambre de l'imagerie. (A) Placer la larve et l'entretoise en plastique sur la couche d'huile. (B) Placez un 22 x 22 mm lamelle sur l'entretoise et insérez la bague de guidage en plexiglas dans la chambre, à côté (C) fixer la position de la larve avec l'anneau de métal et (D) à proximité de la chambre. (E) Maintenant, la chambre est prête à être montée sur le microscope. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 Corps-mur muscles de larves de drosophile. Muscles et NMJs ont été visualisées par l'expression d'une protéine de fusion GFP-CD8-Sh 8. Les muscles sont présentés comme observé lors de la focalisation à la face ventrale à travers la cuticule dans la larve. Dans (AC) le muscle le plus superficiel, 27 ans, est montré, dans (KL) les muscles les plus intérieurs, 6 et 7, sont représentés. Barre d'échelle: 100 um, Az entre deux tranches est de 2 um. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 Identité de tégument muscles de larves de drosophile. L'identité des muscles en L3 drosophile larves, A3 segment, est montré. Muscles et NMJs ont été visualisées par l'expression d'une protéine de fusion GFP-CD8-Sh 8. Les muscles sont affichés comme observé lors de la focalisation à la face ventrale à travers la cuticule dans les larves. En AC le muscle le plus superficiel, 27 ans, est montré, dans KL les muscles les plus intérieurs, 6 et 7, sont représentés. Barre d'échelle: 100 um, Az entre deux tranches est de 2 um. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 Identité des jonctions neuromusculaires des larves de drosophile. (AD) NMJs ont été visualisés par expression d'une protéine de fusion DGluRIIA-MRFP 1. Le NMJs sont présentés comme observé lors de la focalisation à la face ventrale à travers la cuticule dans la larve. Dans (AB) le plus superficiel JNM, 27 ans, est montré, dans le CD du NMJs plus intérieure, 6 et 7, sont représentés. Barre d'échelle: 100 um, Az entre deux tranches est de 5 um. (E) et (F) l'identité du superficiel (E) et plus intérieure (F) NMJs est donnée à titre de référence.

<ol><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li>
<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+vivo+imaging+of+long-term+changes+in+the+Drosophila+neuromuscular+system+%5B%5D%22">In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]</a>. , Georg-August-University Göttingen. (1988).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &amp, Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
</ol>

La méthode présentée a été initialement développé pour étudier les synapses glutamatergiques sur les muscles de la paroi du corps de Drosophila melanogaster larves. La drosophile jonction neuromusculaire (JNM) est caractérisé par une architecture de cyto-stéréotypée des muscles et les neurones et est donc idéal pour l&#39;imagerie in vivo. Cependant, le protocole décrit anesthésie n&#39;est pas limité à l&#39;imagerie de la JNM, la transparence des larves de drosophile facilite l&#39;adaptation du protocole décrit pour étudier le développement des organes, la migration des cellules, le transport de fret axonale et sub-cellulaire de réorganisation au sein des cellules.

Réactifs: <ul><li> Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Allemagne) </li><li> D&#39;huile sur les halocarbures (ex Voltalef H10S huile / Atofina, Puteaux, France) </li><li> Fly milieu de culture </li></ul> Equipement: <ul><li> Inversé microscope confocal </li><li> Microscope binoculaire (par exemple Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Allemagne) </li><li> Petit pinceau comme utilisé pour trier les mouches </li><li> Incubateur </li><li> Personnalisé de chambre construite imagerie (Pour les dessins mécaniques voir réf. 3) </li><li> Vaporisateur / anesthésie appareil (Pour plus de détails voir Réf. 3) </li></ul>

l&#39;imagerie in vivo chez la drosophile larves intact au sub-cellulaire résolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Des améliorations récentes dans l&#39;imagerie optique, les fluorophores génétiquement codés et des outils génétiques permettant l&#39;établissement efficace de lignées d&#39;animaux transgéniques souhaités ont permis de processus biologiques à étudier dans le contexte d&#39;une vie, et même dans certains cas se comporter, de l&#39;organisme. Dans ce protocole, nous allons décrire comment anesthésier intacte larves de drosophile, en utilisant les anesthésiques volatils desflurane, pour suivre le développement et la plasticité synaptique des populations à une résolution sub-cellulaire 1-3. Alors que d&#39;autres méthodes utiles pour anesthésier les larves de Drosophila melanogaster ont été décrits précédemment 4,5,6,7,8, le protocole présentés ici démontrent des améliorations significatives pour les raisons suivantes combinées principales caractéristiques: (1) Un très haut degré de l&#39;anesthésie, même les battement de coeur est arrêté permettant la résolution latérale de 150 nm 1, (2) un taux de survie élevé des&gt; 90% par cycle anesthésie, permettant l&#39;enregistrement de plus de cinq points de temps sur une période de deux heures à plusieurs jours et ( 3) une sensibilité élevée qui nous permet dans 2 cas à étudier la dynamique des protéines exprimées à des niveaux physiologiques. Dans le détail, nous avons été en mesure de visualiser la sous-unité du récepteur du glutamate postsynaptique GluR-IIA exprimé via le promoteur endogène dans une écurie lignées transgéniques et la ligne de trappe exon FasII-GFP 1. (4) Contrairement aux autres méthodes 4,7 larves peuvent être imagées non seulement vivant, mais aussi intacte (c&#39;est à dire non disséqué) permettant l&#39;observation de se produire sur un nombre de jours 1. Les détails vidéo d&#39;accompagnement de la fonction des différentes parties de la chambre de l&#39;imagerie in vivo 2,3, le montage correct de la larve, la procédure de l&#39;anesthésie, la manière de ré-identifier des postes spécifiques au sein d&#39;une larve et l&#39;élimination sûre des larves de l&#39;imagerie Chambre.

Ce protocole décrit une méthode fiable pour l&#39;anesthésie et l&#39;imagerie de intactes<em&gt; Drosophila melanogaster</emLarves&gt;. Nous avons utilisé les anesthésiques volatils desflurane pour permettre l&#39;imagerie répétitive au sub-cellulaire de résolution et de ré-identification des structures pour un maximum de quelques jours<sup&gt; 1</sup&gt;.

L&#39;imagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

Les progrès récents de l'imagerie optique, des fluorophores encodés génétiquement et des outils génétiques permettant l'établissement efficace d'animaux transgéniques souhaités...

Les percées dans le domaine de l'imagerie optique et des capteurs génétiquement codés de force ont permis aux scientifiques d'étudier les processus biologiques qui les intéressent, dans des organismes vivants et, dans certains cas, même chez des organismes en activité. Bien qu'une grande attention ait été portée à l'étude du cerveau des mammifères in vivo, notre laboratoire utilise un système modèle relativement simple, la jonction neuromusculaire troph, et dans la vidéo suivante, nous expliquerons comment anesthésier et imager des larves de drosophile afin de suivre l'évolution de synapses individuelles au fil du temps, sur une période allant de plusieurs heures à plusieurs jours, comme méthode d'étude du développement alimentaire. Bien que des méthodes existent, le protocole présenté ici se caractérise par les points clés suivants.Tout d'abord, grâce à un degré très élevé d'analgésie, même les battements cardiaques sont arrêtés, ce qui est essentiel pour obtenir une qualité d'image élevée. Deuxièmement, grâce à un taux de survie de 95 % et à la capacité d'acquérir des images très sensibles. Le protocole suivant nous permet, par exemple, d'étudier la dynamique des récepteurs du glutamate marqués avec la GFP et exprimés à des niveaux physiologiques sous la dépendance de leurs promoteurs endogènes.Vous allez apprendre maintenant comment insérer les larves dans la chambre d'imagerie, comment anesthésier le fruit pour les larves, comment localiser une position spécifique au sein des larves afin d'observer l'escalier des signaux, puis également comment récupérer les larves après l'imagerie. Avant l'imagerie in vivo, il est important de laver les larves. Bien que ce processus soit simple, il faut prendre soin de ne pas endommager les larves ; par conséquent, les pinces ne sont jamais utilisées pour les déplacer.Au lieu de cela, nous optons pour des mouvements doux à l’aide d’une brosse. L’eau utilisée pour le lavage est à température ambiante et il s’agit simplement d’eau du robinet ordinaire, non distillée et ne contenant aucun détergent. Nous pouvons vous voir.Il déplace délicatement les larves hors de la nourriture et dans de l'eau du robinet fraîche afin d'obtenir de bons résultats. Il est également essentiel de maintenir les larves dans l'eau pendant un temps aussi court que possible. Cela empêchera l'eau d'entrer dans leur trachée, ce qui entrave la respiration ainsi que le processus d'anesthésie.Ensuite, nous préparons la chambre d'imagerie. Tout d'abord, nous appliquons une couche très fine d'huile sur l'élément inférieur de la chambre. Nous plaçons ensuite les larves au-dessus de ce film d'huile.Il est important de veiller ici à ce que les extrémités de vos fils ne touchent pas l'huile. Une fois en place, nous positionnons une grille entretoise au-dessus des larves. Il est essentiel que les trois canaux soient orientés vers le haut, permettant ainsi d'apporter de l'air aux larves et d'éviter qu'ils ne s'obstruent avec l'huile.Nous plaçons maintenant une lamelle au-dessus de l'espaceur et vérifions que la larve est correctement positionnée, c'est-à-dire que son côté ventral est orienté vers le bas et que son côté dorsal, terminé par les trachées que nous pouvons voir, est orienté vers le haut. Ensuite, nous ajoutons un anneau adaptatif en plastique ainsi qu'un anneau métallique afin de s'assurer que la larve est uniformément pressée entre les deux lames de verre supérieures.Nous fermons maintenant la chambre d'imagerie et la déplaçons vers le microscope confocal pour commencer l'acquisition d'images. À présent, vous placez la chambre d'imagerie contenant les larves montées sur le microscope confocal.Il y a trois tubes qui sortent de la chambre d'imagerie. L'un est relié à l'agent anesthésiant, le difluorure. Un autre est un tube de sortie et le dernier tube permet à l'air frais d'atteindre les larves.Après avoir raccordé la chambre à larves au dispositif d'anesthésie, il est important de s'assurer que la larve est correctement positionnée. Yao laisse ensuite entrer de l'air dans le système d'anesthésie par l'intermédiaire de la pompe. À ce stade, il est essentiel de veiller à ce que la pression dans la chambre ne dépasse pas la valeur maximale recommandée.Il place ensuite le tube de sortie dans l'eau afin de s'assurer qu'il y a un débit d'air. Les bulles dans la bouteille d'eau montrent la circulation de l'air. Il ouvre maintenant lentement la vanne et laisse le difluor s'écouler brièvement à travers les tubes.Après l'anesthésie initiale, il est important de vérifier comment la lave réagit. Si le cœur bat encore, il est nécessaire d'appliquer une anesthésie supplémentaire, comme on peut le constater. Dans la section suivante, nous vous montrerons la lave au microscope.Nous pouvons maintenant observer la partie critique du processus d'anesthésie au microscope. Au départ, on peut voir les mouvements des larves, les muscles continuant de se contracter. Une fois que les mouvements commencent à ralentir, ya effectue des balayages de haut en bas sur les larves et observe l'anesthésie en cours.Les mouvements ralentissent et s'arrêtent finalement. Après l'application de plusieurs impulsions d'anesthésie, on observe que la larve a cessé de bouger et que le seul mouvement visible est dû à des ajustements du microscope. Pour déterminer le degré d'anesthésie, il est important de vérifier les battements cardiaques.He yao se concentre profondément sur la lave où l'on peut principalement observer le corps gras. Il est important de noter que la région entourant le cœur est visible, et il est évident que les battements cardiaques ont été arrêtés ; ainsi, la larve est prête à être imagée. Une difficulté majeure liée à l'imagerie in vivo est l'identification de la jonction neuromusculaire qui vous intéresse.Pour vous aider dans cette tâche, nous allons montrer à quoi cela ressemble lorsque vous examinez les larves. Vous pourrez alors observer une jonction neuromusculaire que nous utilisons généralement pour l'imagerie. Nous commençons maintenant à focaliser lentement sur les larves.En partant de la surface de la cuticule, vous verrez apparaître et disparaître certains muscles. Certains de ces muscles sont mis en évidence. La vidéo montre un construit d'hybridation artificiel contenant le domaine transmembranaire CD huit, la GFP et la région C-terminale de la protéine du canal à fer Shaker.Ce construit se localise dans toutes les membranes musculaires et présente une présence accrue au niveau de la jonction neuromusculaire. Nous allons maintenant visionner le film plus lentement et, à l'aide des figures deux et trois, vous pourrez identifier les muscles individuels au fur et à mesure de leur apparition et disparition. Bien que ces mouches soient particulièrement utiles pour apprendre l'imagerie in vivo, nous utilisons généralement des larves exprimant des marqueurs, étiquetant uniquement les régions post-synaptiques ou pré-synaptiques de la synapse.Comme elles ne marquent pas toute la surface musculaire, il est beaucoup plus difficile d'identifier la même position chez les larves. Dans ce film, nous montrons des récepteurs du glutamate marqués par une protéine fluorescente rouge (RFP). Le film montre un focus progressif vers l'organe de l'équilibre (labe) et nous avons mis en évidence des jonctions neuromusculaires individuelles.Nous allons revoir le film plus lentement et vous pourrez identifier les jonctions neuromusculaires individuelles à l'aide de la figure quatre. À présent, nous disposons de la théorie. Nous allons démontrer un exemple pratique.Nous allons maintenant nous concentrer sur la jonction neuromusculaire 27 chez les larves exprimant GFP sous le promoteur MHC CD huit et porteuses de la mutation shaker. Après avoir augmenté le zoom numérique, nous repositionnons la jonction neuromusculaire, puis nous déplaçons dans la direction C vers la région centrale afin de nous assurer que la larve est correctement positionnée et qu’il n’y a aucun pixel sur- ou sous-exposé. Vous pouvez observer les pixels sur-exposés en rouge, tandis que les pixels sous-exposés apparaissent en bleu par comparaison.Nous réduisons la puissance du laser et effectuons une nouvelle numérisation. Nous disposons désormais d'un gain et d'une intensité laser appropriés, de sorte qu'il n'y a plus de régions suréchantillonnées. Il est maintenant important de marquer la position de la jonction neuromusculaire dans la direction C.Tout d'abord, nous marquons la position de balayage inférieure, puis la position de balayage supérieure, afin d'enregistrer précisément l'ensemble de la pile CST. Nous utilisons généralement une taille de pixel de 100 nanomètres par 100 nanomètres et la distance selon C est de 500 nanomètres. Si nous ne prévoyons pas d'effectuer une déconvolution après l'acquisition pour traiter nos images, les gains sont réglés à un niveau approprié pour éviter le bruit, tout en permettant l'utilisation d'une intensité laser plus faible afin de minimiser le photoblanchiment une fois la pile CST terminée.La jonction neuromusculaire exprimant la construction M-H-C-C-D-H shaker GFP est correctement enregistrée. Dans la section suivante, nous réalisons un processus similaire en nous concentrant sur les récepteurs du glutamate. Pour enregistrer les récepteurs du glutamate marqués par la protéine RFP, nous focalisons à nouveau à travers la cuticule et observons maintenant les jonctions neuromusculaires individuelles dans le segment A3.Après avoir effectué un zoom sur la jonction neuromusculaire droite, nous la repositionnons au centre du champ de vision. Comme précédemment, nous devons nous assurer qu'aucun pixel n'est sur- ou sous-exposé. Là encore, il est évident que certains pixels sont saturés ; nous ajustons donc les paramètres et effectuons un nouveau balayage d'essai.Les gains de la puissance laser sont désormais correctement ajustés. Il est maintenant important de définir les limites de la pile CST en identifiant d'abord la position supérieure et en la vérifiant, puis la position inférieure. Nous pouvons maintenant commencer à balayer les plans individuels de la jonction neuromusculaire.Il est important d'effectuer quelques balayages témoins de sections situées juste en dessous et juste au-dessus de la jonction neuromusculaire afin d'éviter de manquer certaines synapses positionnées à ces endroits. Une fois que les confocaux auront terminé le balayage, nous projeterons la jonction neuromusculaire pour observer un résultat typique obtenu en imagerie in vivo. Il est essentiel de conserver cette image pour la comparer à des balayages réalisés à des points temporels ultérieurs, afin de pouvoir réidentifier la jonction neuromusculaire et détecter d'éventuelles modifications, telles que l'apparition de nouvelles synapses ou de batonnets synaptiques.Après avoir terminé l'imagerie avec succès. Il est important de réveiller rapidement la lave et de la retirer rapidement de la chambre d'imagerie. Yao effectue cette étape en ce moment tout en surveillant continuellement la lave ; il règle l'appareil d'anesthésie afin que de l'air frais, plutôt que du fluor seul, circule dans le système.Il place maintenant la sortie de la chambre dans l'eau, et les bulles d'air montrent que l'air circule dans le système. Il surveille continuellement les larves pour s'assurer que le battement cardiaque reprend et que la larve se réveille. Comme lors du processus d'anesthésie, il est préférable de fournir aux larves plusieurs impulsions d'air afin d'assurer un réveil réussi.Nous pouvons maintenant observer ce que fait ya au microscope. Nous pouvons voir lorsqu'il applique de l'air au système. Des changements de pression sont générés dans la chambre, ce qui induit des mouvements artificiels chez les larves.Éventuellement, la larve commence à bouger de manière autonome, ce qui est mieux mis en évidence par l'initiation des mouvements cardiaques ; nous nous concentrons donc sur la larve afin de voir ces mouvements plus clairement. Les battements rythmiques observés indiquent un réveil réussi de la larve. Une fois la larve correctement réveillée, il est important de la récupérer à partir de la chambre d'imagerie.La larve se trouve dans la section inférieure de la chambre, et le couvercle supérieur est donc mis de côté. Yara retire le poids en métal et le couvercle en plastique. Ensuite, la lame couvre est enlevée, puis l'espacement en plastique contenant la larve.Il retire soigneusement les larves du caisson en plastique à l’aide du pinceau. Ensuite, il les trempe brièvement dans l’eau et les essuie pour éliminer tout excès d’huile. Les larves sont maintenant placées dans un peu de nourriture préalablement broyée et y restent jusqu’à ce qu’elles soient à nouveau nécessaires.

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Un protocole est présenté qui permet la visualisation de Drosophila melanogaster intact à n’importe quel stade de développement à l’aide de la tomographie microcalculée.

Imagerie d’animaux entiers de Drosophila melanogaster à l’aide de la tomographie microcalculée

Présenté ici est un protocole de microinject et simultanément l’image de plusieurs embryons de Drosophila au cours du développement embryonnaire à l’aide d’une plaque à base, imageur à haute teneur.

Préparation et microinjection d’embryons de drosophile pour la microscopie cellulaire vivante effectuée à l’aide d’un analyseur automatisé à contenu élevé

Ici, un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie d’expansion dans les embryons précoces de drosophile afin d’obtenir une imagerie à super-résolution à l’aide d’un microscope confocal conventionnel à balayage laser est présenté.

Utilisation de la microscopie d’expansion pour agrandir physiquement des embryons de drosophile entiers pour l’imagerie à super-résolution

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle

Découvrez une méthode d'anesthésie au desflurane pour l'imagerie in vivo de larves de Drosophila melanogaster à haute résolution. Ce protocole permet d'étudier la dynamique synaptique sur plusieurs jours avec un taux de survie de 95%.

L'imagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

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