Méthodes de manipulations expérimentales après section du nerf optique dans le SNC des mammifères

Les cellules ganglionnaires rétiniennes sont des neurones du système nerveux central qui transmettent des informations visuelles de la rétine au cerveau via le nerf optique. Dans la vidéo d’accompagnement, une méthode a été démontrée pour ex-sodomiser ou couper les axones de l’ensemble de la population RGC comme modèle de mort des cellules neurales apoptotiques dans le système nerveux central adulte. Ici, cette méthode est associée à des procédures qui ciblent directement les facteurs neurotrophiques, les ARN interférents courts, les plasmides ou les vecteurs viraux qui codent pour des protéines anti-ATO vers les cellules ganglionnaires rétiniennes lésées ou la rétine pour cibler la rétine à l’échelle mondiale.

Un appareil d’injection intraoculaire est assemblé et utilisé pour injecter des substances dans la chambre vitrée de l’œil afin de cibler spécifiquement les cellules ganglionnaires de la rétine. Soit Gelfoam est placé, soit une seringue Hamilton est utilisée pour injecter des substances dans le nerf optique. Les résultats de l’imagerie du moignon indiquent que la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes peut être augmentée par l’administration de facteurs anti-apoptotiques.

À l’aide de ces techniques, cette méthode peut être utilisée pour identifier les protéines impliquées dans l’apoptose des neurones adultes dans le système nerveux central. Les implications de cette technique s’étendent au traitement ou au diagnostic de la maladie du système nerveux central, car la section du nerf optique est un modèle reproductible de l’apoptose neuronale dans le SNC adulte. Pour préparer le système de seringue pour les injections intraoculaires, commencez par retirer toute aiguille ou écrou RN.

Présent sur une seringue Hamilton de 10 microlitres rn gast tight1701. Insérez le PFA sauvage dans la coupelle de pointe sauvage du raccord à compression. Insérez ensuite le raccord complet dans l’extrémité de la seringue et vissez sans serrer l’écrou RN sur le dessus.

Insérez une extrémité d’un tube de pic de 16e pouce dans le raccord à compression par l’ouverture de l’écrou RN. Assurez-vous que le tube de la visière est bien en place. Serrez l’écrou RN pour comprimer le sauvage, ce qui scellera le tube de pointe.

Répétez ce processus aux deux extrémités du coupleur de verre à double RN. Fixez l’extrémité libre du tube de pic à une extrémité du coupleur en verre double RN en serrant le support de l’écrou RN. La micro-pipette en verre formera l’aiguille et le corps du système d’injection.

Insérez la pipette en verre dans l’extrémité libre du coupleur en verre double RN. Serrez l’écrou RN pour fixer la pipette en place. À l’aide d’un microscope à dissection, créez une pointe d’un diamètre approprié en tenant une micropipette tirée en biais et en frottant la pointe le long du givrage du verre d’une lame de verre pour créer une rupture.

Idéalement, la pointe finale doit être légèrement biseautée. Ensuite, à l’aide d’un kit d’amorçage de Hamilton Syringe Company rempli d’une seringue, d’un linker de tube de pointe, d’un coupleur en verre à double RN et d’une micro-pipette en verre avec de l’huile minérale à utiliser. Avec le système d’injection hydraulique, remplacez l’aiguille par une aiguille Hamilton 9 0 0 3 0.

Ensuite, placez un septum en caoutchouc sur l’aiguille Hamilton 9 0 0 3 0 pour assurer l’étanchéité lors de l’injection de l’huile minérale. Insérez l’aiguille Hamilton 9 0 0 3 0 de la seringue d’amorçage à l’arrière du corps de la seringue Hamilton de 10 microlitres du système d’injection. Appuyez fermement le septum contre l’extrémité de la seringue pour créer un joint.

Appuyez lentement sur le piston, l’huile minérale passera à travers les éléments en verre du système d’injection. Remplissage de la pipette en verre. Poussez toute l’huile à travers le système d’injection afin d’éliminer toutes les bulles d’air le long du tractus.

Si la seringue de remplissage est à court d’huile minérale, retirez lentement l’aiguille tout en distribuant constamment de l’huile. Pour éviter la formation de bulles d’air, remplissez la seringue d’amorçage et injectez à nouveau. Lorsque l’ensemble du système est rempli d’huile minérale, insérez le piston d’origine du 10 microlitres.

Seringue Hamilton enfoncez complètement le piston pour éliminer l’huile minérale supplémentaire du système. Essuyez la micropipette en verre et l’extrémité de la seringue. Avec 70 % d’éthanol, retirez le piston jusqu’à la marque de deux microlitres sur le canon.

L’extrémité de la micro-pipette en verre se remplira d’air, fournissant une zone tampon entre l’huile minérale et le fluide à injecter. Remplissez le corps de la pipette en plaçant l’extrémité de la micro-pipette dans la solution souhaitée et en retirant le piston de la seringue Hamilton. Pas plus de quatre à cinq microlitres de solution seront injectés dans un œil de rat adulte pour effectuer l’injection intraoculaire.

Commencez par basculer le flux de gaz vers la fixation du masque à gaz pour le cadre stéréotaxique. Placez ensuite un rat anesthésié au fluor dans l’appareil stéréotaxique. Baissez la concentration de fluor à 2 % et surveillez l’anesthésie.

Couvrez l’animal avec une couverture chirurgicale. Pour maintenir la température corporelle tout au long de la chirurgie, ouvrez les paupières et placez une goutte de solution anesthésique d’acane. À la surface de la cornée, l’injection nécessite deux personnes, l’une pour insérer la pipette en verre dans la chambre vitrée et maintenir la position de la pipette.

Et un autre pour appuyer sur le piston de la seringue, qui délivre la solution souhaitée. Sous un microscope chirurgical, saisissez la micro-pipette en verre et le coupleur en verre double RN, écartez les paupières en formant une forme en V à l’opposé du site d’injection Avec les doigts, l’œil s’élèvera hors de l’orbite. Insérez doucement l’extrémité de la micropipette en verre à travers une zone dépourvue de vaisseaux sanguins et à travers la sclère à un angle vers le bas.

Lorsque la pipette pénètre dans la sclère, un petit pop se fait sentir. La personne qui tient la seringue doit maintenant injecter quatre microlitres de solution en appuyant sur le piston jusqu’à la marque de deux microlitres sur la seringue. L’injection devrait prendre environ une à deux secondes.

La solution injectée avec succès s’écoule à travers la chambre vitrée, maintient la micropipette stable pendant environ cinq secondes, puis se retire dans la même direction Lorsque l’aiguille a été insérée, la conjonctive retombera sur la petite ouverture, aidant à sceller la ponction sclérale. Une fois l’opération terminée, coupez l’alimentation en fluor et laissez l’animal respirer de l’oxygène pendant plusieurs minutes. Couvrez la surface de la cornée avec une pommade ophtalmique pour les yeux Afin d’éviter le dessèchement de la cornée pendant la récupération, retirez l’animal du dispositif stéréotaxique et remettez-le dans la cage de récupération.

Manipuler les cellules ganglionnaires de la rétine par transport rétrograde après une extomie. Effectuez d’abord une transsection du nerf optique selon les instructions du protocole de transsection du nerf optique vidéo d’accompagnement, 2, 2, 4, 1 traceurs médicaments. Des plasmides, des siRNA ou des vecteurs viraux peuvent être appliqués sur le moignon du nerf optique.

Il existe deux méthodes principales pour accomplir cette procédure en utilisant de la mousse de gel ou une injection directe dans le nerf optique. Si la méthode de la mousse de gel est utilisée, assurez-vous que les cellules ganglionnaires de la rétine ont été pré-marquées en injectant des traceurs rétrogrades dans le colliculus supérieur une semaine avant la taxonomie. Immédiatement après que le nerf optique est coupé, placez un petit morceau de mousse de gel imbibé de la solution expérimentale sur le moignon du nerf optique transecté, le contenu orbitaire est ensuite renvoyé à l’emplacement précédent.

Lorsque l’œil est ramené à une position neutre, utilisez une pince pour pousser le morceau de mousse de gel dans l’orbite, en vous assurant qu’il reste au-dessus de l’extrémité du nerf optique. La technique d’injection est plus efficace pour l’administration de substances qui doivent accéder au cytoplasme de l’axone afin d’être rétro grandement transportées par le flux plasmique, Une seringue Hamilton étanche à gaz de 10 microlitres est utilisée pour injecter la solution souhaitée dans le nerf optique transecté. Une aiguille avec un biseau court est souhaitable.

Chargez la seringue avec 10 microlitres de la solution à injecter. Typiquement des plasmides d’ARNr ou des vecteurs viraux à injecter saisissent le bord du nerf optique avec une pince de Dumont à pointe fine. Insérez l’extrémité de l’aiguille dans le nerf optique, parallèlement au nerf.

Jusqu’à ce que le biseau ne soit plus visible, l’aiguille insérée sera enfermée de tous les côtés par le nerf. Une fois l’aiguille insérée, pressez doucement les côtés du nerf avec la pince à pointe fine et injectez un quart de la solution tout en tournant la seringue. Un quart de tour dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.

Répétez ces étapes jusqu’à ce qu’une rotation complète de l’aiguille soit terminée et que tout le contenu de la seringue ait été injecté. Retirez l’extrémité de la seringue du nerf. Laissez tout liquide injecté qui a un reflux du nerf dans l’orbite, car cela formera un bassin supplémentaire pour l’absorption par les extrémités des axones.

Remettez le contenu orbitaire dans sa position initiale, fermez la plaie et laissez l’animal se rétablir. Les animaux doivent être logés de manière indépendante après la chirurgie. Les analgésiques post-chirurgicaux doivent être administrés selon les directives de vos soins aux animaux.

Les autorités et les animaux doivent être surveillés attentivement après l’opération. Comme le montre cette vidéo, la CGR peut être directement ciblée en délivrant des peptides, des médicaments, des vecteurs, des plasmides ou des siRNA au moignon du nerf optique transecté. Dans cet exemple représentatif, un marquage rétrograde de l’or fluoré a été effectué et les peptides marqués SI trois ont été immédiatement injectés dans le nerf optique.

imagerie en direct de la rétine a ensuite été réalisée afin d’empêcher les peptides de s’échapper du tissu lors de la fixation, comme on peut le voir ici, trois peptides marqués SI injectés dans le nerf optique ont été rétro, grandement transportés vers le RGC somato dans la rétine. Dans cet exemple, trois siRNA marqués SI ont été injectés dans le moignon du nerf optique. Immédiatement après la taxotomie et l’imagerie en direct de la rétine, les siRNA marqués SI trois injectés dans le nerf optique étaient rétrogrades, transportés par RG CS comme l’indique leur colocalisation.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques secondes si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de veiller à ne pas endommager l’objectif. N’oubliez pas que travailler avec des particules virales peut être extrêmement dangereux et que les directives institutionnelles pour travailler avec des risques biologiques doivent toujours être suivies lors de l’exécution de cette procédure.