Méthodes de manipulations expérimentales après section du nerf optique dans le SNC des mammifères

Les cellules ganglionnaires de la rétine, ou CCR, sont des neurones du système nerveux central qui transmettent l'information visuelle de la rétine au cerveau via le nerf optique. Dans la vidéo associée, une méthode a été démontrée pour sectionner de façon exsodominale ou couper les axones de l'ensemble de la population de CCR, servant ainsi de modèle de mort cellulaire neuronale par apoptose dans le système nerveux central adulte. Ici, cette méthode est associée à des procédures ciblant directement les facteurs neurotrophiques, les ARN interférents courts, les plasmides ou les vecteurs viraux codant pour des protéines anti-apoptotiques, soit vers les cellules ganglionnaires de la rétine lésées, soit vers la rétine dans son ensemble.

Un appareil d'injection intraoculaire est assemblé et utilisé pour injecter des substances dans la chambre vitrée de l'œil afin de cibler spécifiquement les cellules ganglionnaires de la rétine. Soit de la Gelfoam est placée, soit des seringues Hamilton sont utilisées pour injecter des substances dans le nerf optique. Les résultats d'imagerie des moignons indiquent que la survie des cellules ganglionnaires de la rétine peut être augmentée par l'administration de facteurs anti-apoptotiques.

En utilisant ces techniques, cette méthode peut servir à identifier les protéines impliquées dans l'apoptose neuronale chez l'adulte dans le système nerveux central. Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement ou le diagnostic des maladies du système nerveux central, car la section du nerf optique constitue un modèle reproductible d'apoptose neuronale dans le SNC adulte. En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés car elles endommagent le cristallin lors de l'insertion de la pipette en verre dans la chambre vitrée de l'œil. Pour préparer le système de seringue destiné aux injections intraoculaires, commencez par retirer toute aiguille ou écrou RN.

Présent sur une seringue Hamilton de 10 microlitres à frittage gast hermétique 1701. Insérez le ferral en PFA dans le ferral du cône du raccord de compression. Ensuite, insérez l'ensemble du raccord dans l'extrémité de la seringue et vissez légèrement l'écrou RN par-dessus.

Insérez une extrémité d'un tube capillaire de 1/16 de pouce dans le raccord de compression en le faisant passer par l'ouverture de l'écrou RN. Assurez-vous que le tube capillaire est complètement en place. Serrez l'écrou RN pour comprimer le ferule, ce qui assurera l'étanchéité du tube capillaire.

Répétez ce processus aux deux extrémités du coupleur en verre RN double. Fixez l'extrémité libre du tube pointe à l'une des extrémités du coupleur en verre RN double en resserrant l'écrou RN. La micropipette en verre formera l'aiguille et le corps de la seringue pour le système d'injection.

Insérez la pipette en verre dans l'extrémité libre du coupleur en verre RN double. Serrez l'écrou RN pour fixer la pipette en place. Sous un microscope stéréo, créez une pointe de diamètre approprié en tenant une micro-pipette étirée selon un angle et en frottant la pointe contre la surface dépolie d'une lame de verre afin de provoquer une cassure.

Idéalement, l'extrémité finale doit être légèrement biseautée. Ensuite, à l'aide d'un kit d'amorçage de Hamilton Syringe Company rempli de seringue, de tube de raccordement, de coupleur en verre RN double et de micropipette en verre avec de l'huile minérale pour utilisation. Avec le système d'injection hydraulique, remplacez l'aiguille par une aiguille Hamilton 9 0 0 3 0.

Placez ensuite un septum en caoutchouc sur l'aiguille Hamilton 9 0 0 3 0 afin d'assurer une étanchéité lors de l'injection de l'huile minérale. Insérez l'aiguille Hamilton 9 0 0 3 0 de la seringue de purge dans l'extrémité arrière du corps de la seringue Hamilton de 10 microlitres du système d'injection. Appuyez fermement le septum contre l'extrémité de la seringue pour créer une étanchéité.

Appuyez lentement sur le piston afin que l'huile minérale traverse les éléments en verre du système d'injection. Remplissez la pipette en verre. Poussez toute l'huile à travers le système d'injection afin d'éliminer toutes les bulles d'air présentes le long du trajet.

Si la seringue de remplissage manque d'huile minérale, retirez lentement l'aiguille tout en distribuant constamment de l'huile. Pour éviter la formation de bulles d'air, rechargez la seringue de purge et injectez à nouveau. Lorsque l'ensemble du système est rempli d'huile minérale, insérez le piston d'origine de la seringue de 10 microlitres.

Avec la seringue de Hamilton, appuyer complètement sur le piston pour éliminer l'excès d'huile minérale du système. Nettoyer soigneusement la micropipette en verre et l'extrémité de la seringue. À l'aide d'éthanol à 70 %, tirer le piston jusqu'au repère de deux microlitres sur le corps de la seringue.

L'extrémité de la micropipette en verre se remplira d'air, créant ainsi une zone tampon entre l'huile minérale et le liquide à injecter. Remplissez le corps de la pipette en plongeant l'extrémité de la micropipette dans la solution souhaitée et en retirant le piston de la seringue Hamilton. Pas plus de quatre à cinq microlitres de solution seront injectés dans l'œil d'un rat adulte pour réaliser l'injection intraoculaire.

Commencez par basculer le flux de gaz vers l'embout du masque à gaz pour le cadre stéréotaxique. Ensuite, placez un rat anesthésié à l'isoflurane dans l'appareil stéréotaxique. Réduisez la concentration d'isoflurane à 2 % et surveillez l'anesthésie.

Couvrez l'animal avec une couverture chirurgicale. Pour maintenir la température corporelle tout au long de l'intervention, ouvrez les paupières et appliquez une goutte de solution anesthésique ophtalmique. L'injection sur la surface de la cornée nécessite deux personnes : l'une pour insérer la pipette en verre dans la chambre vitrée et maintenir la position de la pipette.

Et une autre pour enfoncer le piston de la seringue, qui délivre la solution souhaitée. Sous un microscope chirurgical, saisissez la micropipette en verre et le coupleur en verre RN double, écartez les paupières en formant une forme en V opposée au site d'injection. À l’aide des doigts, l’œil s’élèvera hors de l’orbite. Insérez délicatement la pointe de la micropipette en verre à travers une zone dépourvue de vaisseaux sanguins et à travers la sclérotique selon un angle descendant.

Lorsque la pipette pénètre la sclérotique, on ressentira un petit claquement. La personne tenant la seringue doit alors injecter quatre microlitres de solution en appuyant sur le piston jusqu'au repère de deux microlitres sur la seringue. L'injection doit prendre environ une à deux secondes.

La solution injectée avec succès circulera dans la chambre vitrée, maintenez la micropipette immobile pendant environ cinq secondes, puis retirez-la dans la même direction que celle utilisée pour l'insertion de l'aiguille. La conjonctive se rabattra alors sur la petite ouverture, aidant ainsi à sceller la perforation sclérale. Une fois la chirurgie terminée, éteignez l'isoflurane et laissez l'animal respirer de l'oxygène pendant plusieurs minutes. Appliquez une pommade ophtalmique sur la surface de la cornée afin d'éviter le dessèchement cornéen pendant la récupération, puis retirez l'animal de l'appareil stéréotaxique et remettez-le dans la cage de récupération.

Pour manipuler les cellules ganglionnaires de la rétine par transport rétrograde après une exotomie. Commencez par réaliser une transection du nerf optique selon les instructions du protocole de transection du nerf optique présenté dans la vidéo associée, 2, 2 4, 1 traceurs médicaments. Des plasmides, des ARNsi ou des vecteurs viraux peuvent être appliqués sur le moignon du nerf optique.

Il existe deux méthodes principales pour réaliser cette procédure : l'utilisation de mousse de gel ou l'injection directe dans le nerf optique. Si la méthode de la mousse de gel est utilisée, assurez-vous que les cellules ganglionnaires de la rétine ont été préalablement marquées par l'injection de traceurs rétrogrades dans le colliculus supérieur une semaine avant la taxonomie. Immédiatement après la section du nerf optique, placez un petit morceau de mousse de gel imprégné de la solution expérimentale sur le moignon du nerf optique sectionné, puis remettez les contenus orbitaires à leur emplacement d'origine.

Lorsque l'œil est ramené en position neutre, utilisez une pince pour enfoncer le morceau de mousse de gel dans l'orbite, en veillant à ce qu'il reste au-dessus de l'extrémité du nerf optique. La technique d'injection est plus efficace pour l'administration de substances qui doivent pénétrer dans le cytoplasme de l'axone afin d'être rétrogradement transportées par le flux axoplasmique. Une seringue Hamilton étanche de 10 microlitres est utilisée pour injecter la solution souhaitée dans le nerf optique sectionné. Une aiguille à biseau court est préférable.

Chargez la seringue avec 10 microlitres de la solution à injecter. Habituellement, des plasmides d'ARNi ou des vecteurs viraux à injecter, saisissez le bord du nerf optique avec des pinces Dumont à pointe fine. Insérez l'extrémité de l'aiguille dans le nerf optique, parallèlement au nerf.

Jusqu'à ce que le biseau ne soit plus visible, l'aiguille insérée sera entourée de tous côtés par le nerf. Une fois l'aiguille insérée, pincez délicatement les côtés du nerf avec la pince à pointe fine et injectez un quart de la solution tout en faisant tourner la seringue. Un quart de tour dans le sens horaire ou antihoraire.

Continuez à répéter ces étapes jusqu'à ce qu'un tour complet de l'aiguille soit effectué et que tout le contenu de la seringue ait été injecté. Retirez la pointe de la seringue du nerf. Laissez tout liquide injecté qui remonte du nerf à l'intérieur de l'orbite, car cela formera un réservoir supplémentaire pour l'absorption par les extrémités des axones.

Replacer le contenu orbital dans sa position d'origine, fermer la plaie et laisser l'animal se remettre. Les animaux doivent être logés individuellement après la chirurgie. Des analgésiques postopératoires doivent être administrés conformément aux directives de votre service de soins aux animaux.

Les autorités et les animaux doivent être soigneusement surveillés après la chirurgie. Comme le montre cette vidéo, les cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) peuvent être directement ciblées en administrant des peptides, des médicaments, des vecteurs, des plasmides ou des ARNsi au moignon du nerf optique sectionné. Dans cet exemple représentatif, un marquage rétrograde au fluoro gold a été réalisé et trois peptides marqués SI ont été injectés immédiatement dans le nerf optique.

L'imagerie en direct de la rétine a ensuite été réalisée afin d'éviter que les peptides ne s'échappent du tissu lors de la fixation, comme on peut le voir ici : trois peptides marqués au SI injectés dans le nerf optique ont été transportés de manière rétrograde jusqu'aux corps cellulaires des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) dans la rétine. Dans cet exemple, trois siARN marqués au SI ont été injectés dans le moignon du nerf optique. Immédiatement après la section du nerf optique, une nouvelle imagerie en direct de la rétine a été effectuée, révélant que les siARN marqués au SI injectés dans le nerf optique avaient été transportés de façon rétrograde par les RGC, comme en témoigne leur colocalisation.

Avec un marquage rétrograde au FluoroGold, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques secondes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre soin d'éviter d'endommager l'objectif. N'oubliez pas que le travail avec des particules virales peut être extrêmement dangereux, et que les directives institutionnelles relatives à la manipulation des agents biologiques doivent toujours être suivies lors de l'exécution de cette procédure.