Name: Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:01:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Découvrez comment assembler un microendoscope à fibre optique haute résolution pour l'imagerie cellulaire in situ en temps réel. Cette méthode économique permet d'observer les processus cellulaires dans leur microenvironnement natif.

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Cette recherche a été financée en partie par les Instituts nationaux de la santé, accorder R01 EB007594, le ministère de la Défense du sein Le cancer du Programme de recherche, proposition BCO74699P7, et la Fondation Susan G. Komen octroi 26152/98188972.

1. Assemblée Microendoscope Le microendoscope haute résolution décrit ici (figure 1a) devrait être considéré comme une configuration de base avec plusieurs variations possibles dans l'assemblage et l'application. Nous décrivons en détail ici une réalisation de la plate-forme qui est conçu pour être utilisé avec proflavine comme agent de contraste fluorescents. Proflavine est une brillante tache avec nucléaires pic d'absorption et d'émission de longueurs d'onde de 445 nm et 515 nm, respectivement. L'utilisation d'agents de contraste d'autres auront besoin de l'utilisateur de sélectionner l'excitation, d'émission, et des filtres dichroïques de manière appropriée. Plusieurs éléments de l'microendoscope haute résolution sont génériques et peuvent être obtenus auprès de plusieurs fournisseurs. Par exemple, les composants opto-mécaniques de positionnement sont disponibles à partir Thorlabs, Newport, Linos, entre autres. Compact caméras CCD sont disponibles auprès de sociétés telles que Point Grey Research, Prosilica, et Retiga; sensibilité de la caméra doit être choisi en tenant compte de la luminosité du fluorophore à être utilisé, ainsi que la cadence désirée. Haute puissance des diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être obtenus à partir de Luxeon, des Cris et Nichia, entre autres. Fibre optique faisceaux sont disponibles auprès de Sumitomo, Fujikura, et Schott. Dans la sélection des composants pour une application spécifique, l'utilisateur devrait considérer les relations inhérentes à la microscopie par fluorescence entre la concentration de fluorophore, photoblanchiment, intensité de l'illumination, sensibilité de la caméra, le gain et le temps d'exposition. <ol><li> Branchez le 6 "tiges cage pour les 1,5" tiges cage, pour former une paire de 7.5 "de longues tiges. Vissez ces tiges dans une face de l'unité de miroir pli. Visser le 0,5" tiges dans la face opposée. Faites glisser le cube cage sur les tiges de la cage, en passant par les deux inférieurs à travers les trous. Vissez les deux "tiges dans la face latérale du cube cage (figure 1b). </li><li> Fixez la caméra sur une plaque de la cage en utilisant une monture C à l'adaptateur SM1. Fixez la plaque sur la cage de 0,5 tiges cage », affleure la face de l'unité de miroir pli. </li><li> Insérez le «tube» dans une lentille de 3 "lentille de tube long et sécuriser l'objectif avec une bague de retenue. La longueur focale de l'objectif doit être choisie de telle sorte que les noyaux du faisceau de fibres optiques sont échantillonnés par au moins deux pixels lors de la projection sur la caméra. Déposer le filtre d'émission dans le tube au-dessus du premier anneau de retenue et ajouter une autre bague pour fixer le filtre en place. Respectez la convention d'orientation du filtre indiqué par le fabricant du filtre. Vissez la lentille de tube sur le côté de la cube de la cage la plus proche de la caméra CCD. Notez que dans la figure 1c, cette lentille et le filtre sont présentés sans le tube 3 lentilles "pour plus de clarté. </li><li> Connectez l'appareil à un ordinateur et afficher l'image sur l'écran. Diriger l'ensemble cage à un objet lointain et faites glisser le cube en cage le long des rails jusqu'à une image apparaît au point. Verrouiller le cube en cage à cet endroit. (Ceci est une méthode simple de s'assurer que la lentille de tube forment une image focalisée lorsqu'il est combiné avec l'infini-corrigés objectif). </li><li> Insérez le miroir dichroïque dans le support et le lieu à 45 ° dans le cube en cage. </li><li> Vissez la lentille de l'objectif, via une RMS pour SM1 adaptateur de filetage et d'un tube lentille réglable, à la face du cube en cage en face de la porte-lentille de tube. Un z-traducteur peut être utilisé à la place du tube de lentille réglable pour faciliter la mise au point. Vis un connecteur SMA dans une plaque de cage et de monter ce sur les tiges, approximativement à la distance de travail de l'objectif. </li><li> Monter une LED sur une plaque en cage et glisser sur la fin de la 2 "barres. Ajouter une lentille à un 0,5" tube d'objectif tel que, lorsque ce tube est vissé dans le côté du cube en cage, il va former une image de la LED qui remplit l'ouverture arrière de l'objectif. Cette configuration (éclairage de Köhler) fera en sorte que la face proximale du faisceau de fibres optiques est uniformément éclairé. Ajouter le filtre d'excitation dans le tube 0,5 lentilles "et fixer en place avec un anneau de retenue (figure 1c). </li><li> Attachez un connecteur SMA à un faisceau de fibres optiques. Vissez le bundle SMA connectorisés dans le réceptacle de SMA montés sur les tiges de la cage. Direct de l'extrémité distale du faisceau vers une source lumineuse à large bande (éclairage fluorescent suffira) et d'observer l'image du visage bundle proximale sur la caméra CCD. Ajustez la position de la lentille de l'objectif en vissant ou en dehors du cube cage jusqu'à ce que l'image apparaît dans faisceau de fibres de discussion. Les noyaux individuels devraient être clairement visibles (figure 2). </li></ol> 2. Assemblée Objectif GRIN La résolution spatiale de l'microendoscope peut être augmentée en ajoutant un micro-lentille ou d'assemblage de lentilles à l'extrémité distale du faisceau de fibres. Ces optiques sont configurés de telle sorte que, au lieu de placer la pointe bundle directement sur le tissu, la pointe est reflétée sur la surface du tissu avec démagnification, augmentant ainsi la fréquence d'échantillonnage spatiales imposées par le GUID lumièreING noyaux du faisceau de fibres. Le degré de démagnification correspond à l'augmentation de la résolution spatiale, et dans le même temps, à une diminution proportionnelle dans le champ de vision. Composants lentilles à gradient d'indice (GRIN) sont compatibles avec la fibre optique et sont disponibles à partir GrinTech, NSG, Schott, entre autres, et peut être directement lié à l'extrémité distale d'un faisceau de fibres. <ol><li> Sélectionnez une lentille GRIN avec le grossissement désiré et la distance de travail pour votre application. S'assurer que le diamètre de la lentille est supérieure à celle du faisceau de fibres que vous prévoyez de travailler avec. Nous recommandons que le faisceau de fibres et de lentilles GRIN être monté sur 3 axes séparés platines de positionnement manuel sous un microscope de faible puissance ou stéréoscope pour un alignement précis avant le collage. </li><li> Déposer une goutte de colle optique (par exemple, Norland adhésifs UV) sur la lentille ou le visage bundle. Apportez les deux composantes en contact en utilisant les positionneurs manuel. Exposer l'interface à la lumière UV pour la dose recommandée par le fabricant. </li><li> Pour protéger la lentille GRIN et l'interface collés, une courte longueur de tube d'aluminium capillaire (petites pièces Inc) peut être utilisé pour enfermer l'articulation. Faites glisser le tube sur le joint et fixer en place à l'époxy. Gaine thermorétractable peut être utilisée pour terminer l'assemblage. </li></ol> 3. Imagerie Microendoscope <ol><li> Appliquer l'agent de contraste pour les cellules ou les tissus à imager. Avec proflavine (0,01% p / v dans du PBS), dans l'imagerie in vitro des cellules en culture peut être effectuée par une brève incubation (&lt;1 minute) et un rinçage complet. Imagerie des spécimens de tissus ex vivo ou in vivo dans les tissus est possible après l'application topique de la teinture. L'absorption de proflavine dans ces conditions, a été trouvé pour être quasi instantanée, avec l'imagerie possible en quelques secondes et durable pendant plusieurs minutes. </li><li> Placez le faisceau de fibres optiques en contact léger avec l'échantillon à imager. Lorsque les cellules d'imagerie dans la culture ou ex vivo des échantillons de tissus, nous recommandons le montage de l'extrémité distale du faisceau de fibres dans un dispositif de sécurité avec des étapes de positionnement manuel sur les axes XYZ pour la stabilité pendant l'imagerie. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Une fois assemblé correctement, le microendoscope fonctionnera comme un microscope à épifluorescence, relayée par une stratégie cohérente de fibre optique bundle. Pour des résultats optimaux d'imagerie, l'attention devrait être accordée pour s'assurer que trois conditions principales sont remplies: <ol><li> La face proximale du faisceau de fibres devrait être imagés sur la caméra CCD sans défocalisation, afin de parvenir à la résolution complète du système. Figure 2a, b, c montrent une partie d'un faisceau de fibres imagé avec un accent pauvres, défocalisation légère, et se concentrer bonne, respectivement. L'accent est optimale en ajustant la position axiale de la lentille de l'objectif relativement à la face bundle. </li><li> La face proximale du faisceau de fibres doivent être uniformément éclairée sur son plein diamètre (champ de vision). Comme décrit dans le texte du Protocole (1,7), ceci est réalisé en configurant l'optique d'illumination pour l'éclairage de Kohler. Figure 2D montre une image acquise lors d'un échantillon homogène fluorescente est illuminé dans cette configuration préférée, avec la figure 2e démontrant le résultat correspondant sous un éclairage critique. Dans ce dernier cas, la structure de la LED est reflétée sur le visage faisceau de fibres, résultant en l'apparition de ce modèle indésirables superposée à la structure de l'échantillon vrai. </li><li> Les deux visages proximales et distales du faisceau de fibres doit être propre et exempt de rayures et de copeaux. Figure 2f démontre la présence de débris attachée à la face bundle, avec des dégâts sous la forme d'une petite puce à 5 heures sur le périmètre de la fibre. Les débris peuvent être retirés de la liasse des visages par le nettoyage de la même façon que conventionnelles connecteurs à fibres optiques, avec du papier d'objectif et l'isopropanol, ou des outils standard de nettoyage de fibre optique. Si l'une des extrémités du faisceau de fibres est rayé ou ébréchées, ou si le faisceau des pauses le long de sa longueur, le visage peut être poli à plat par manuel standard, ou des techniques de polissage mécanique. Nous vous recommandons de 12-15 um clapotis de papier pour un poli initial grossier, avec un vernis final sur du papier de 0.5 à 1.0 um. </li></ol> La figure 3a montre l'imagerie de 1483 cellules in vitro, après marquage avec le placement proflavine et la lumière du faisceau de fibres nues sur l'échantillon. Figure 3b montre l'amélioration de la résolution spatiale et la réduction du champ de vision fourni par une lentille GRIN 2.5x collée à l'extrémité bundle. Film 1 montre l'imagerie in vivo de la plaquette mammaires de graisse dans un modèle murin. Ici, un faisceau de fibres avec 0,5 mm de diamètre extérieur (330 um champ de vue) a été passé à travers une aiguille de calibre 21 et avancé dans le tissu. Les cellules adipeuses sont clairement visibles, avec des mouvements dus au cycle cardiaque apparente dans cette acquisition à 15images par seconde. La figure 3c montre l'imagerie de la muqueuse buccale chez un volontaire humain sain, en utilisant cette fois un ensemble plus large en fibre avec 1,5 mm de diamètre extérieur (1,4 mm champ de vue). Dans tous les exemples présentés, proflavine a été utilisé comme un agent de contraste marquage nucléaire fluorescent. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Assemblage du microendoscope haute résolution (HRME). Schéma (a) du système HRME. (B) de l'Assemblée de la structure de soutien optomécanique principal. (C) l'ajout d'éléments optiques, éclairage LED, et une caméra CCD. (D) photographie du système HRME, emballé dans un 10 "x 8" x 2,5 "enclos. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Configuration du HRME. Des exemples de l'imagerie avec le faisceau de fibres optiques en (a) se concentrent pauvres, (b) à proximité de concentrer une bonne, (c) focalisation idéale. En (d), une cible homogène fluorescente à l'extrémité distale du bundle est imagé dans Kohler (uniforme) d'illumination. (E) un objectif uniforme fluorescente sous un éclairage critique imagée, avec la structure apparente de la source sur l'objet. (F) les tissus en vrac et les cellules peuvent se coller au visage faisceau de fibres, qui est également sujette à des dommages mineurs à sa périphérie. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Imagerie avec le HRME. (A) 1483 cellules in vitro, imagé avec un faisceau de fibres nues (IGN-08/30) suivant le marquage avec proflavine 0,01% (p / v). (B) Le même 1483 la culture de cellules, comme indiqué en (a), imagé avec un faisceau de fibres avec une lentille GRIN 2.5x ci-joint. (C) Image de la muqueuse buccale normale humains in vivo, après l'application topique de proflavine 0,01% (p / v). Film 1. Imagerie mammaire de la plaquette en graisse d'un souris via l'insertion d'un diamètre de 450 um faisceau de fibres extérieures dans la lumière d'une aiguille de calibre 21 passés dans le tissu. Proflavine 0,01% (p / v) a été livré sur le site d'imagerie par la même aiguille avant l'insertion de la fibre d'imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1%202306_Pierce_movie1.avi">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a>

<ol><li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li>
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<li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
<li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li>
<li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost%2C+high+performance%2C+self-aligning+miniature+optical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li>
</ol>

MP et DY n&#39;ont rien à révéler. RRK détient des brevets relatifs aux plates-formes d&#39;imagerie microendoscopic.

La technique de haute résolution microendoscopy décrit fournit ici des chercheurs dans les domaines de la recherche biomédicale fondamentale et clinique avec une méthode flexible, robuste et rentable pour la visualisation de détails cellulaires in situ. Nous avons décrit un protocole pour l&#39;assemblage du système d&#39;imagerie et démontré son utilisation en culture cellulaire in vitro et chez l&#39;animal, et les tissus humains in vivo. Bien que les résultats présentés ici imagerie utilisée proflavine comme agent de contraste fluorescents, d&#39;autres groupes ont démontré les versions du système d&#39;éclairage à LED longueurs d&#39;onde et les filtres choisis pour correspondre à excitation / émission des spectres d&#39;autres colorants 5-7. Résolution et champ de vue sont déterminés initialement par l&#39;espacement des core-to-core et le diamètre de l&#39;imagerie du faisceau de fibres optiques. Nous avons utilisé faisceaux avec environ 4 um core-core espacement, et des diamètres de 330 um d&#39;imagerie (film 1), 720 um (figure 2, figure 3a, b), et 1400 um (figure 3C). Les faisceaux plus petits peut être transmis par des aiguilles de calibre étroit et sont nettement plus souples que les fibres plus grandes. Nous et les autres 8 ont, dans certains cas, a noté l&#39;apparition d&#39;émissions de l&#39;autofluorescence de la fibre elle-même bundle. Lors d&#39;une tentative pour exciter des fluorophores aux longueurs d&#39;ondes UV, ou de collecter des émissions dans la gamme spectrale rouge, une attention devrait être portée au niveau de l&#39;autofluorescence fibré contribuant à l&#39;ensemble du signal mesuré. Alors que la plupart des travaux à haute résolution microendoscopy rapporté à ce jour a utilisé un faisceau de fibres nues, un grossissement supplémentaire peut être fournie par l&#39;utilisation de lentilles GRIN collée à l&#39;extrémité distale. Lentilles GRIN offre un moyen simple et économique pour augmenter la résolution spatiale, bien que leur sensibilité aux aberrations optiques et limité NA est bien reconnu. Si les performances lentilles GRIN est insuffisante pour une application particulière, GRIN hybride / objectifs lentille sphérique 9 ou miniatures assemblées objectif 10-11 peuvent être employées. Le microendoscope haute résolution décrit ici essentiellement fonctionne comme un grand champ épifluorescence microscope; donc pas de sectionnement optique (comme en microscopie confocale ou non linéaire) est à prévoir. Dans notre expérience, en utilisant la lumière d&#39;excitation 455 nm et proflavine actualité comme agent de contraste, la lumière est principalement recueillies à une profondeur correspondant à une des couches de cellules rares. Ce protocole devrait permettre au lecteur de rassembler les microendoscope haute résolution sur la paillasse, avec un encombrement réduit de 10 &quot;x 8&quot;. Si désiré, le système peut être enfermé dans une boîte et les composants électriques (LED et d&#39;une caméra) alimenté par une batterie (figure 1d). Beaucoup de caméras compactes peuvent être alimentés par l&#39;IEEE-1394 (Firewire) et des ports USB de l&#39;ordinateur hôte.

<table><tbody><tr><td>Caméra CCD</td><td>Point Grey Research</td><td>GRAS-14S5M</td><td></td></tr><tr><td>DEL</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>M455L2</td><td>Sélectionné pour une utilisation avec la proflavine &amp;#8211; d'autres fluorophores peuvent nécessiter des composants différents</td></tr><tr><td>Filtre d'excitation</td><td>Semrock</td><td>452/45</td><td>Sélectionné pour une utilisation avec la proflavine &amp;#8211; d'autres fluorophores peuvent nécessiter des composants différents</td></tr><tr><td>Filtre d'émission</td><td>Semrock</td><td>550/88</td><td>Sélectionné pour une utilisation avec la proflavine &amp;#8211; d'autres fluorophores peuvent nécessiter des composants différents</td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>485 DCLP</td><td>Sélectionné pour une utilisation avec la proflavine &amp;#8211; d'autres fluorophores peuvent nécessiter des composants différents</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RMS 10X</td><td></td></tr><tr><td>Lentille tubulaire</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC-254-150-A1</td><td>Sélectionner la longueur focale pour obtenir l'agrandissement requis sur la caméra CCD</td></tr><tr><td>Lentille de condenseur</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ACL2520</td><td></td></tr><tr><td>Unité en cube de cage</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td><td></td></tr><tr><td>Tiges et plaques de cage</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td><td></td></tr><tr><td>Unité de miroir de redressement</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>KCB1, PF10-03-G01</td><td></td></tr><tr><td>Tubes pour lentilles</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (ou SM1Z)</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateurs / coupleurs</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs SMA</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1SMA, 11040A</td><td></td></tr><tr><td>Pilote de DEL</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDD1B TPS001</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de fibres optiques</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>IGN-08/30</td><td>Des faisceaux plus grands ou plus petits sont disponibles (Sumitomo / Fujikura)</td></tr></tbody></table>

haute résolution à fibre optique pour les microendoscopy in situ cellular imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

De nombreuses études biologiques et cliniques nécessitent l&#39;étude longitudinale et l&#39;analyse de la morphologie et la fonction avec une résolution au niveau cellulaire. Traditionnellement, les multiples expériences fonctionnent en parallèle, avec des échantillons individuels retirés de l&#39;étude à des temps séquentiels pour l&#39;évaluation par microscopie optique. Plusieurs techniques ont été développées intravitale, avec confocale, multiphotonique, microscopie et deuxième harmoniques toutes démontrant leur capacité à être utilisé pour l&#39;imagerie dans une situ. Avec ces systèmes, cependant, l&#39;infrastructure nécessaire est complexe et coûteuse, impliquant des systèmes de balayage laser et les sources de lumière complexes. Nous présentons ici un protocole pour la conception et l&#39;assemblage d&#39;un microendoscope haute résolution qui peut être construite en un jour à l&#39;aide off-the-shelf composants pour moins de 5000 $ US. La plateforme offre une grande flexibilité en termes de résolution d&#39;image, le champ de vision, et l&#39;exploitation d&#39;onde, et nous décrivons comment ces paramètres peuvent être facilement modifiés pour répondre aux besoins spécifiques de l&#39;utilisateur final. Nous et les autres ont exploré l&#39;utilisation de l&#39;microendoscope haute résolution (HRME) en culture cellulaire in vitro 2-5, en 6 excisée et les tissus des animaux qui vivent 2,5, et dans les tissus humains in vivo 2,7. Les utilisateurs ont rapporté l&#39;utilisation de plusieurs agents de contraste fluorescents, y compris proflavine 2-4, anneau de monoacide benzoporphyrine dérivés A 5 (BPD-MA), et 6,7 fluorescéine, qui ont tous reçu plein, ou l&#39;approbation d&#39;investigation de la FDA pour une utilisation chez des sujets humains. Haute résolution microendoscopy, sous la forme décrite ici, peut faire appel à un large éventail de chercheurs travaillant dans le domaine des sciences fondamentales et cliniques. Cette technique offre une approche efficace et économique qui complète la microscopie traditionnelle paillasse, en permettant à l&#39;utilisateur d&#39;effectuer à haute résolution, imagerie longitudinales in situ.

Dans de nombreuses situations cliniques et biologiques, il est avantageux d&#39;étudier les processus cellulaires à mesure qu&#39;ils évoluent dans leur microenvironnement natale. Nous décrivons ici le montage et l&#39;utilisation d&#39;un faible coût par fibre optique de microscope qui peut fournir l&#39;imagerie en temps réel dans la culture cellulaire, les études animales et des études cliniques sur le patient.

Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

De nombreuses études biologiques et cliniques nécessitent l'étude longitudinale et l'analyse de la morphologie et de la fonction avec une résolution à l'échelle cellulaire.

Les études biologiques et cliniques nécessitant une analyse microscopique à une résolution au niveau cellulaire ont traditionnellement été réalisées en effectuant plusieurs expériences en parallèle, avec des échantillons prélevés individuellement de l'étude à des points de temps séquentiels pour être évalués par microscopie optique, tandis que la microscopie confocale, la microscopie multiphoton et la microscopie par génération de seconde harmonique constituent toutes des techniques utiles pour l'imagerie in situ. L'infrastructure requise est complexe et coûteuse, impliquant des systèmes laser à balayage et des sources lumineuses complexes. Ici, nous démontrons comment construire en une seule journée un système d'endoscope micro-optique à fibre haute résolution, en utilisant des composants disponibles dans le commerce pour moins de 5 000 dollars américains.La plateforme offre une flexibilité en ce qui concerne la résolution d'image, le champ de vision et la longueur d'onde de fonctionnement. Tout d'abord, un cadre de microscope à fluorescence en épifluorescence simple est assemblé afin d'accueillir une source lumineuse, des filtres optiques, des lentilles, un faisceau de fibres optiques et une caméra CCD. Ensuite, les lentilles d'imagerie sont installées, ce qui permet de former une image agrandie du faisceau de fibres optiques sur la caméra CCD.Une source à LED est ensuite installée avec des optiques d'éclairage afin de fournir une lumière d'excitation fluorescente à l'échantillon. Enfin, grâce au micro-endoscope assemblé, l'imagerie en temps réel révèle des détails au niveau cellulaire d'échantillons marqués par fluorescence, y compris des cultures in vitro, des modèles animaux in vivo et des sujets humains. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale ou la microscopie à deux photons est qu'elle est suffisamment simple et peu coûteuse pour que les chercheurs travaillant dans des domaines variés puissent la mettre en œuvre rapidement et la personnaliser selon leurs besoins spécifiques.L'endoscope microscopique à haute résolution décrit ici doit être considéré comme une configuration de base permettant plusieurs variantes en matière d'assemblage et d'application. Lors du choix des composants pour une application spécifique, tenez compte des relations inhérentes en microscopie de fluorescence entre la concentration du fluorochrome, l'illumination provoquant le photoblanchiment, l'intensité, la sensibilité de la caméra, le gain et le temps d'exposition. Cette plateforme est conçue pour être utilisée avec la pro-flavine comme agent de contraste fluorescent, mais peut être configurée pour fonctionner avec d'autres colorants fluorescents.Le pro-flavine est une coloration intense du noyau présentant des longueurs d'onde d'absorption et d'émission maximales respectivement de 445 nanomètres et 515 nanomètres. L'utilisation d'autres agents de contraste exigera que l'utilisateur sélectionne correctement les filtres d'excitation, d'émission et dichroïques afin de monter le système de micro-endoscope. Commencez par relier deux tiges de cage de six pouces à deux tiges de cage de 1,5 pouce pour former une paire de tiges longues de 7,5 pouces. Vissez les tiges dans une face de l'unité de miroir plié, puis installez un miroir de un pouce de diamètre.Ensuite, vissez quatre tiges de 0,5 pouce sur la face opposée de l'unité de miroir pliant. Glissez le cube de cage sur les tiges de cage de 7,5 pouces par les deux trous traversants inférieurs. Vissez les tiges de deux pouces sur la face latérale du cube de cage.À l’aide d’un adaptateur C mount vers SM1, fixez la caméra sur une plaque de cage. Fixez la plaque de cage sur les tiges de cage de 0,5 pouce, alignées au niveau de la face de l’unité de miroir de redoublement. Sélectionnez une lentille tubulaire de un pouce de diamètre afin de former une image du faisceau de fibres optiques sur la caméra.La distance focale de l'objectif doit être choisie de sorte que la cause du faisceau de fibres optiques soit échantillonnée par au moins deux pixels. Lors de l'acquisition d'une image sur la caméra, insérez l'objectif dans un tube d'objectif de trois pouces de longueur et fixez-le à l'aide d'un anneau de maintien. Une clé à ergots est utile pour visser les bagues de maintien dans les tubes d'objectif longs.Déposez le filtre d'émission dans le tube de lentille de trois pouces, au-dessus du premier anneau de maintien, puis ajoutez un autre anneau pour fixer le filtre en place. Veillez à ce que l'orientation du filtre respecte la convention indiquée par le fabricant. Vissez le tube de lentille sur le côté du cube de cage le plus proche de la caméra CCD.Cette position est également indiquée ici. Notez que, sur le schéma, cet objectif et ce filtre sont représentés sans le tube d'objectif de trois pouces. Pour plus de clarté, connectez la caméra à un ordinateur et visualisez l'image à l'écran.Diriger l'ensemble de la cage vers un objet éloigné et faire glisser le cube de cage le long des rails jusqu'à ce qu'une image nette de l'objet apparaisse. Utiliser un tournevis pour serrer les quatre vis situées sur les côtés du cube de cage. Ces vis se bloquent sur les rails lorsqu'elles sont serrées, maintenant ainsi le cube en position.Cela garantira que les lentilles de tube forment une image focalisée du faisceau de fibres sur la caméra lorsqu'elles sont combinées avec l'objectif corrigé à l'infini. Ensuite, insérez le miroir dichroïque dans son support et placez-le à 45 degrés dans le cube de cage. Vissez l'objectif à l'aide d'un adaptateur de filetage RMS vers SM et d'un tube de lentille réglable sur la face du cube de cage opposée au support de lentille de tube.Ensuite, vissez un connecteur SMA sur une plaque de cage et fixez-la aux tiges, approximativement à la distance de travail de l'objectif. Ajoutez la plaque de base et le capuchon terminal aux côtés ouverts du cube de cage. Puis, montez une LED sur une plaque de cage et glissez-la à l'extrémité des tiges de deux pouces.Ajoutez une lentille à un tube de lentille de 0,5 pouce de manière à ce que, lorsque ce tube est vissé sur le côté du cube de cage, il forme une image de la DEL qui remplit l'ouverture arrière de l'objectif. Ajoutez également le filtre d'excitation au tube de lentille. À ce stade, un pilote de DEL peut être utilisé pour contrôler l'intensité de la lumière d'illumination à l'aide d'époxy.Fixer un connecteur SMA pour une fibre de 1030 microns sur le faisceau de fibres optiques dont le champ de vision mesure 720 microns. Pour plus de détails sur le raccordement des fibres optiques, consulter T Thor Labs, numéro de pièce FN nine six. Guide du raccordement et du polissage des fibres optiques.Vissez le faisceau d'yeux du connecteur SMA dans la douille SMA montée sur la tige de la cage. Orientez l'extrémit&shy;&eacute; distale du faisceau vers une source de lumi&egrave;re large bande ; un &eacute;clairage fluorescent conviendra. Ensuite, observez l'image de la face proximale du faisceau sur la cam&eacute;ra CCD. Enfin, r&eacute;glez la position de l'objectif en le vissant ou d&eacute;vissant dans le cube de la cage.Jusqu'à ce que l'image du faisceau de fibres apparaisse nette, la cause individuelle doit être clairement visible. La résolution spatiale du micro-endoscope peut être augmentée en fixant une micro-lentille ou un ensemble de lentilles à l'extrémité distale du faisceau de fibres. Ces optiques sont configurées de manière à ce que, au lieu de placer directement l'extrémité du faisceau sur le tissu, celle-ci soit projetée sur la surface du tissu avec une réduction du grossissement.Augmentant ainsi la fréquence d'échantillonnage spatiale imposée par le guidage de la lumière dû au faisceau de fibres. Le degré de réduction de la taille de l'image correspond à l'augmentation de la résolution spatiale et, en même temps, à une diminution proportionnelle du champ de vision. Sélectionnez une lentille GRIN avec le grossissement et la distance de travail souhaités pour votre application.Veillez à ce que le diamètre de la lentille corresponde à celui du faisceau de fibres avec lequel vous prévoyez de travailler. Montez le faisceau de fibres et la lentille grin sur des supports de positionnement manuels à trois axes séparés, sous un microscope à faible grossissement ou un stéréomicroscope, afin d'assurer un alignement précis.Placez ensuite une goutte d'adhésif optique sur la lentille ou sur la face du faisceau. À l'aide des positionneurs manuels, rapprochez les deux composants jusqu'au contact. Exposez l'interface à la lumière UV selon la dose recommandée par le fabricant afin de polymériser l'adhésif.Pour protéger l'objectif grin et l'interface collée, utilisez un court morceau de tube capillaire en aluminium afin d'entourer la jonction. Faites glisser le tube sur la jonction et fixez-le en place à l'aide d'une goutte d'époxy à chaque extrémité du tube, puis utilisez un manchon thermorétractable pour terminer l'assemblage. Avant l'imagerie micro-endoscopique, appliquez l'agent de contraste sur les cellules ou le tissu à imager afin de visualiser les cellules et la culture.Commencez par éliminer le milieu de croissance à l’aide d’une pipette. Ensuite, ajoutez la solution de pro-flavine en pipetant délicatement dans le puits. Après une courte incubation d’au maximum une minute, retirez la solution de pro-flavine à l’aide d’une pipette et jetez-la.Rincez les cellules en ajoutant et en retirant une solution fraîche de PBS vers le puits. Montez l'extrémité distale du faisceau de fibres dans un support fixe équipé de plateformes de positionnement manuel selon les axes X, Y et Z pour assurer la stabilité. Pendant l'acquisition d'images après l'application du colorant sur les cellules ou le tissu, placez le faisceau de fibres optiques en contact léger avec l'échantillon. Visualisez l'image du faisceau de fibres optiques sur l'écran d'ordinateur, soit à l'aide du logiciel fourni par le fabricant de la caméra, soit à l'aide de tout logiciel personnalisé que vous souhaiteriez développer.Réglez le temps d'exposition et les paramètres de gain de la caméra pour obtenir une image de luminosité acceptable. Lorsqu'il est correctement assemblé, le micro-endoscope fonctionne comme un microscope à fluorescence en épiscopie, relayé par un faisceau cohérent de fibres optiques. Pour des résultats d'imagerie optimaux, il convient de s'assurer que trois conditions essentielles sont remplies.Tout d'abord, la face proximale du faisceau de fibres doit être projetée sur la caméra CCD sans défocalisation afin d'atteindre la résolution maximale du système. Ici, une portion d'un faisceau de fibres est imagée avec une mise au point médiocre, légèrement floue et bien mise au point. La mise au point optimale est obtenue en ajustant la position réelle de l'objectif par rapport à la face du faisceau.Deuxièmement, la face proximale du faisceau de fibres doit être uniformément éclairée sur tout son diamètre. Comme décrit précédemment, cela est obtenu en configurant l'optique d'éclairage pour un éclairage de type colinéaire. L'image présentée ici a été acquise lorsqu'un échantillon fluorescent uniforme est éclairé selon cette configuration privilégiée.Le résultat correspondant en illumination critique est affiché ici. La structure de la DEL est projetée sur la face du faisceau de fibres, ce qui entraîne l'apparition de ce motif indésirable superposé à la structure réelle de l'échantillon. Troisièmement, il est important de s'assurer que les faces proximale et distale du faisceau de fibres soient propres et exemptes de rayures et d'éclats.Dans cet exemple, des débris d'image sont attachés à la surface du faisceau et un dommage sous la forme d'une petite écaille à cinq heures est visible sur le pourtour de la fibre. Les débris peuvent être éliminés des surfaces du faisceau par nettoyage, de la même manière que pour les connecteurs optiques conventionnels, à l'aide de papier-lensette et d'isopropanol ou d'outils standards de nettoyage des fibres optiques. 1483 cellules ont été marquées avec de la pro-flavine et le faisceau de fibre nu a été délicatement posé sur l'échantillon.L'imagerie in vitro est présentée ici lorsque qu'une lentille grin de 2,5 x a été fixée à l'extrémité du faisceau, ce qui a permis une amélioration de la résolution spatiale et une réduction du champ de vision. Une imagerie in vivo a été réalisée en introduisant un faisceau de fibres d'un diamètre externe de 0,5 millimètre à travers une aiguille de calibre 21, puis en l'avançant dans le tissu du bourrelet adipeux mammaire d'une souris ; comme on peut le voir dans ce film, les adipocytes sont clairement visibles, avec des mouvements dus au cycle cardiaque. Dans cet exemple, l'imagerie de la muqueuse buccale chez un volontaire humain en bonne santé a été effectuée à l'aide d'un faisceau de fibres plus grand, d'un diamètre externe de 1,5 millimètre.Dans tous les exemples, la pro-flavine a été utilisée comme agent de contraste fluorescent pour le marquage nucléaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception et du montage d'un micro-endoscope à fibres optiques pour l'imagerie de fluorescence en C deux de cellules et de tissus.

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