Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Les études biologiques et cliniques nécessitant une analyse microscopique à une résolution au niveau cellulaire ont traditionnellement été réalisées en effectuant plusieurs expériences en parallèle, chaque échantillon étant prélevé de l'étude à des points de temps séquentiels pour être évalué par microscopie optique, tandis que la microscopie confocale, la microscopie multiphotonique et la microscopie par génération de seconde harmonique constituent toutes des techniques utiles pour l'imagerie in situ. L'infrastructure requise est complexe et coûteuse, impliquant des systèmes laser à balayage et des sources lumineuses sophistiquées. Ici, nous démontrons comment construire en une seule journée un système d'endoscope micro-optique à fibre haute résolution, en utilisant des composants disponibles dans le commerce pour moins de 5 000 dollars américains.

La plateforme offre une flexibilité en ce qui concerne la résolution d'image, le champ de vision et la longueur d'onde de fonctionnement. Tout d'abord, un cadre de microscope à fluorescence en épifluorescence simple est assemblé afin d'accueillir une source lumineuse, des filtres optiques, des lentilles, un faisceau de fibres optiques et une caméra CCD. Ensuite, les lentilles d'imagerie sont installées, ce qui permet de former une image agrandie du faisceau de fibres optiques sur la caméra CCD.

Une source à LED est ensuite installée avec des optiques d'éclairage afin de fournir une lumière d'excitation fluorescente à l'échantillon. Enfin, à l'aide du micro-endoscope assemblé, l'imagerie en temps réel révèle des détails au niveau cellulaire d'échantillons marqués par fluorescence, y compris des cultures in vitro, des modèles animaux in vivo et des sujets humains. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale ou la microscopie à deux photons réside dans sa simplicité et son faible coût, ce qui permet aux chercheurs travaillant dans des domaines variés de la mettre en œuvre rapidement et de la personnaliser selon leurs besoins spécifiques.

L'endoscope microscopique à haute résolution décrit ici doit être considéré comme une configuration de base permettant plusieurs variantes en matière d'assemblage et d'application. Lors du choix des composants pour une application spécifique, tenez compte des relations inhérentes en microscopie de fluorescence entre la concentration du fluorochrome, l'illumination provoquant le photoblanchiment, l'intensité, la sensibilité de la caméra, le gain et le temps d'exposition. Cette plateforme est conçue pour être utilisée avec la pro-flavine comme agent de contraste fluorescent, mais peut être configurée pour fonctionner avec d'autres colorants fluorescents.

Le pro-flavine est une coloration nucléaire vive dont les longueurs d'onde d'absorption et d'émission maximales sont respectivement de 445 nanomètres et 515 nanomètres. L'utilisation d'autres agents de contraste exigera que l'utilisateur sélectionne correctement les filtres d'excitation, d'émission et dichroïques pour assembler le système de micro-endoscope. Commencez par relier deux tiges de cage de six pouces à deux tiges de cage de 1,5 pouce afin de former une paire de tiges longues de 7,5 pouces. Vissez les tiges dans une face de l'unité de miroir plié, puis installez un miroir de un pouce de diamètre.

Ensuite, vissez quatre tiges de 0,5 pouce sur la face opposée de l'unité de miroir plié. Glissez le cube de cage sur les tiges de cage de 7,5 pouces par les deux trous traversants inférieurs. Vissez les tiges de deux pouces sur la face latérale du cube de cage.

À l’aide d’un adaptateur C mount vers SM1, fixez la caméra à une plaque de cage. Fixez la plaque de cage sur les tiges de cage de 0,5 pouce, alignées avec la face de l’unité du miroir de renvoi. Sélectionnez une lentille tubulaire de diamètre de 1 pouce pour former une image du faisceau de fibres optiques sur la caméra.

La distance focale de l'objectif doit être choisie de sorte que la cause du faisceau de fibres optiques soit échantillonnée par au moins deux pixels. Lors de l'acquisition d'une image sur la caméra, insérez l'objectif dans un tube d'objectif de trois pouces de longueur et fixez-le à l'aide d'un anneau de maintien. Une clé à ergots est utile pour visser les bagues de maintien dans les tubes d'objectif longs.

Déposez le filtre d'émission dans le tube de lentille de trois pouces, au-dessus du premier anneau de retenue, puis ajoutez un autre anneau pour fixer le filtre en place. Veillez à ce que l'orientation du filtre respecte la convention indiquée par le fabricant. Vissez le tube de lentille sur le côté du cube de cage le plus proche de la caméra CCD.

Cette position est également indiquée ici. Notez que, sur le schéma, cet objectif et ce filtre sont représentés sans le tube d'objectif de trois pouces. Pour plus de clarté, connectez la caméra à un ordinateur et visualisez l'image à l'écran.

Dirigez l'ensemble de la cage vers un objet éloigné et faites glisser le cube de cage le long des rails jusqu'à ce qu'une image nette de l'objet apparaisse. Utilisez un tournevis pour serrer les quatre vis situées sur les côtés du cube de cage. Ces vis se bloquent sur les rails lorsqu'elles sont serrées, maintenant ainsi le cube en position.

Cela garantira que les lentilles de tube forment une image focalisée du faisceau de fibres sur la caméra lorsqu'elles sont combinées avec l'objectif corrigé à l'infini. Ensuite, insérez le miroir dichroïque dans son support et placez-le à 45 degrés dans le cube de cage. Vissez l'objectif à l'aide d'un adaptateur de filetage RMS vers SM et d'un tube de lentille réglable sur la face du cube de cage opposée au support de lentille de tube.

Ensuite, vissez un connecteur SMA sur une plaque de cage et fixez-la aux tiges, approximativement à la distance de travail de l'objectif. Ajoutez la plaque de base et le capuchon final aux côtés ouverts du cube de cage. Puis, montez une LED sur une plaque de cage et glissez-la à l'extrémité des tiges de deux pouces.

Ajoutez une lentille à un tube de lentille de 0,5 pouce de manière à ce que, lorsque ce tube est vissé sur le côté du cube de cage, il forme une image de la DEL qui remplit l'ouverture arrière de l'objectif. Ajoutez également le filtre d'excitation au tube de lentille. À ce stade, un pilote de DEL peut être utilisé pour contrôler l'intensité de la lumière d'illumination à l'aide d'époxy.

Fixer un connecteur SMA pour une fibre de 1030 microns sur le faisceau de fibres optiques dont le champ de vision mesure 720 microns. Pour plus de détails sur le raccordement des fibres optiques, consulter T Thor Labs, numéro de pièce FN nine six. Un guide sur le raccordement et le polissage des fibres optiques.

Vissez le faisceau d'yeux du connecteur SMA dans la prise SMA montée sur la tige de cage. Orientez l'extrémité distale du faisceau vers une source de lumière large bande ; un éclairage fluorescent suffira. Ensuite, observez l'image de la face proximale du faisceau sur la caméra CCD. Enfin, ajustez la position de l'objectif en le vissant ou dévissant dans le cube de cage.

Jusqu'à ce que l'image du faisceau de fibres apparaisse nette, la cause individuelle doit être clairement visible. La résolution spatiale du micro-endoscope peut être augmentée en fixant une micro-lentille ou un ensemble de lentilles à l'extrémité distale du faisceau de fibres. Ces optiques sont configurées de manière à ce que, au lieu de placer directement l'extrémité du faisceau sur le tissu, celle-ci soit projetée sur la surface du tissu avec une réduction du grossissement.

Augmentant ainsi la fréquence d'échantillonnage spatiale imposée par l'effet de guidage de la lumière du faisceau de fibres. Le degré de réduction de la taille de l'image correspond à l'augmentation de la résolution spatiale et, simultanément, à une diminution proportionnelle du champ de vision. Sélectionnez une lentille GRIN possédant le grandissement et la distance de travail souhaités pour votre application.

Veillez à ce que le diamètre de la lentille corresponde à celui du faisceau de fibres avec lequel vous prévoyez de travailler. Montez le faisceau de fibres et la lentille GRIN sur des supports manuels de positionnement tridimensionnels séparés, sous un microscope à faible grossissement ou un stéréoscope, afin d'assurer un alignement précis.

Placez ensuite une goutte d'adhésif optique sur la lentille ou sur la face du faisceau. À l'aide des positionneurs manuels, rapprochez les deux composants jusqu'au contact. Exposez l'interface à la lumière UV selon la dose recommandée par le fabricant afin de polymériser l'adhésif.

Pour protéger l'objectif grin et l'interface collée, utilisez un court morceau de tube capillaire en aluminium afin d'enfermer la jonction. Faites glisser le tube sur la jonction et fixez-le en place à l'aide d'une goutte d'époxy à chaque extrémité du tube, puis utilisez un manchon thermorétractable pour terminer l'assemblage. Avant l'imagerie micro-endoscopique, appliquez l'agent de contraste sur les cellules ou le tissu à imager afin de visualiser les cellules et la culture.

Commencez par éliminer le milieu de culture à l’aide d’une pipette. Ensuite, ajoutez la solution de proflavine en pipettant délicatement dans le puits. Après une courte incubation d’une durée maximale d’une minute, retirez la solution de proflavine à l’aide d’une pipette et jetez-la.

Rincez les cellules en ajoutant et en retirant une solution fraîche de PBS au puits. Montez l'extrémité distale du faisceau de fibres dans un support fixe muni de dispositifs de positionnement manuel selon les axes x, y, z pour assurer la stabilité. Pendant l'acquisition d'images après application du colorant sur les cellules ou tissus, placez le faisceau de fibres optiques en contact léger avec l'échantillon. Visualisez l'image du faisceau de fibres optiques sur l'écran d'ordinateur, soit à l'aide du logiciel fourni par le fabricant de la caméra, soit à l'aide de tout logiciel personnalisé que vous souhaiteriez développer.

Réglez le temps d'exposition et les paramètres de gain de la caméra afin d'obtenir une image de luminosité acceptable. Lorsqu'il est correctement assemblé, le micro-endoscope fonctionne comme un microscope à fluorescence en épiscopie, relayé par un faisceau cohérent de fibres optiques. Pour des résultats d'imagerie optimaux, il convient de s'assurer que trois conditions essentielles sont remplies.

Tout d'abord, la face proximale du faisceau de fibres doit être projetée sur la caméra CCD sans défocalisation afin d'atteindre la résolution maximale du système. Ici, une portion d'un faisceau de fibres est imagée avec une mise au point médiocre, légèrement floue et correctement focalisée. La mise au point optimale est obtenue en ajustant la position réelle de l'objectif par rapport à la face du faisceau.

Deuxièmement, la face proximale du faisceau de fibres doit être uniformément éclairée sur tout son diamètre. Comme décrit précédemment, cela est obtenu en configurant l'optique d'éclairage pour un éclairage de type colinéaire. L'image présentée ici a été acquise lorsqu'un échantillon fluorescent uniforme est éclairé dans cette configuration privilégiée.

Le résultat correspondant en illumination critique est montré ici. La structure de la LED est projetée sur la face du faisceau de fibres, ce qui donne lieu à l'apparition de ce motif indésirable superposé à la structure réelle de l'échantillon. Troisièmement, il est important de s'assurer que les faces proximale et distale du faisceau de fibres soient propres et exemptes de rayures et d'éclats.

Dans cet exemple, des débris d'image sont attachés à la surface du faisceau et un dommage sous la forme d'une petite ébréchure à cinq heures est visible sur le périmètre de la fibre. Les débris peuvent être éliminés des surfaces du faisceau par un nettoyage effectué de la même manière que pour les connecteurs optiques conventionnels, à l'aide de papier lens et d'isopropanol, ou avec des outils de nettoyage optique standard. 1483 cellules ont été marquées avec de la pro-flavine et le faisceau de fibres nu a été délicatement placé sur l'échantillon.

L'imagerie in vitro est montrée ici lorsque qu'une lentille grin de 2,5 x a été fixée à l'extrémité du faisceau, ce qui a permis d'améliorer la résolution spatiale et de réduire le champ de vision. Une imagerie in vivo a été réalisée en introduisant un faisceau de fibres d'un diamètre extérieur de 0,5 millimètre à travers une aiguille de calibre 21, puis en l'avançant dans le tissu de la couche grasse mammaire d'une souris ; comme on le voit dans ce film, les adipocytes sont clairement visibles, avec des mouvements dus au cycle cardiaque. Dans cet exemple, l'imagerie de la muqueuse buccale chez un volontaire humain en bonne santé a été effectuée à l'aide d'un faisceau de fibres plus grand, d'un diamètre extérieur de 1,5 millimètre.

Dans tous les exemples, la pro-flavine a été utilisée comme agent de contraste fluorescent pour le marquage nucléaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception et du montage d'un micro-endoscope à fibres optiques pour l'imagerie de fluorescence in C deux de cellules et de tissus.