Name: Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Découvrez l'isolement et la culture de cellules endothéliales pulmonaires de souris néonatales par dissociation enzymatique et purification sur billes magnétiques conjuguées. Cette méthode améliore la pureté et le rendement cellulaire.

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Cette recherche a été financée en partie par l&#39;American Heart Association 0950118G.to octroi MC-W.

1. Préparation anti-PECAM-1-anticorps conjugués des billes magnétiques (Dynabeads) <ol><li> Préparer 0,1% de BSA dans du PBS en mélangeant 50 mg de BSA dans 50 ml de PBS en utilisant un vortex jusqu'à BSA dissout. Stériliser par filtration sur filtre de 0,22 um seringue. Conserver à 4 ° C. </li><li> Dans la hotte de TC, le transfert de 200 pi de bien resuspendu Dynabeads IgG de mouton anti-rat dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et laver les perles: tube mont sur le MPC et laisser reposer pendant environ 1 min pour permettre aux billes de sédiments. Aspirer le surnageant, retirer le tube du MPC et de remettre en suspension les perles dans 1 ml de solution stérile de 0,1% BSA / PBS. Pipeter haut et bas pour resuspendre perles. </li><li> Répétez laver plus de trois fois, pour un total de quatre lavages. </li><li> Retirer le tube du MPC et de remettre en suspension les perles dans 500 ul de 0,1% de BSA / PBS. </li><li> Ajouter 10 ul rat anti-souris PECAM-1 (CD-31) anticorps pour le tube. </li><li> Tumble nuit à 4 ° C dans la chambre froide ou 2 heures à température ambiante. </li><li> Laver les billes avec stériles 0,1% BSA / PBS comme décrit dans l'étape 1.2 à quatre reprises. </li><li> Retirer le tube du MPC et de remettre en suspension les perles dans 200 ul de 0,1% BSA / PBS. Boutique anti-PECAM-1-anticorps conjugués Dynabeads à 4 ° C pour un maximum de 1 mois. </li></ol> 2. Isoler la souris cellules endothéliales pulmonaires chez les souris néonatales Avant de procéder avec le protocole de purification des tissus, IACUC approbation du Comité de la procédure est nécessaire. <ol><li> Préparer les éléments suivants: <ul><li> 15 ml de 1 mg / ml C / D solution dans du DMEM. Filtre avec une seringue 0,22 um filtre et chaude à 37 ° C. </li><li> Tube de 50 ml conique avec 15 ml de DMEM, de stocker sur la glace </li><li> Isolement des médias (IM) contenant 20% de FBS et 1x pénicilline / streptomycine dans le DMEM </li><li> 2% de gélatine. Mélanger 2 g de gélatine bovine peau avec 100 ml d'eau dd, autoclave 15 minutes et conserver à 4 ° C. Chaude à 37 ° C pour liquéfier avant flacons TC revêtement. </li></ul></li><li> Anesthetize trois chiots 6-8 jours anciens en utilisant une injection IP de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Vérifier l'efficacité de l'anesthésie et disséquer des animaux, un par un, comme suit: chiots Pin à bord, faire tremper la peau avec de l'éthanol 70% et enlever la peau de la région de la poitrine avec des ciseaux de dissection stériles. Accise de la cage thoracique afin d'exposer les poumons. </li><li> Aseptiquement accise lobes pulmonaires individuelles, en faisant attention de ne pas disséquer les bronches et les tissus conjonctifs visibles autour des poumons. Combiner tous les poumons glacée DMEM. Euthanasier les chiots. </li><li> Travailler dans la hotte TC, retirez les lobes pulmonaires du DMEM, placer dans un plat de 100 mm TC et aspirer l'excès DMEM. </li><li> L'aide de ciseaux stériles, émincer finement le tissu en coupant ~ 100 fois. Transfert à 15 ml chaleureuse C / D pour la solution de digestion enzymatique. Incuber 45 minutes à 37 ° C sur un agitateur. </li><li> Dans la hotte TC, aspirer la suspension de tissu digéré en une seringue de 20 ml avec 14 g de touffes canule jointe et triturer dans une suspension cellulaire unique, au moins 12 fois. </li><li> Passez la suspension de tissu à travers un tamis 70 pm cellules et laver le filtre avec 15 ml IM à arrêter la digestion. </li><li> Suspension cellulaire par centrifugation à 400x g pendant 5 minutes. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 3 ml de 0,1% BSA / PBS. </li><li> Transfert suspension cellulaire à 5 ml tube de polystyrène à fond rond et ajouter 22,5 ul anti-PECAM-1-anticorps conjugués Dynabeads. Tumble à température ambiante pendant 12 minutes. </li><li> Manteau un flacon T75 avec 2 mL 2% de gélatine et de l'excès d'aspiration de la gélatine. Laisser sécher la gélatine à l'intérieur du capot de TC pendant environ 30 minutes avant de cellules de placage. </li><li> Après une incubation de perles est terminé (étape 2.10), répartis de façon égale en suspension de cellules des tubes Eppendorf trois et monter sur la MPC. </li><li> Lorsque les billes ont sédimentées en utilisant le MPC (~ 1 min), ramasser le surnageant, retirer le tube du MPC, lavez perles avec ~ 1 ml de 0,1% BSA / PBS, puis remontez sur la MPC. </li><li> Répétez laver quatre fois (au total 5 lavages) </li><li> Perles Remettre en suspension dans 1 ml de VascuLife avec des facteurs de vie EnGS-MV Kit et 1x pénicilline / streptomycine (VL) par tube, bien mélanger. </li><li> Plaque sur un pré-enduites flacon T75 et amener le volume total dans chaque flacon de 10 ml avec VL. </li><li> Changer les médias le lendemain, permettra un jour complet de la croissance, puis le changement de la moitié des médias tous les jours. Lorsque les cellules sont&gt; 70-80% confluentes ou plus (généralement après 3-4 jours de culture), ils peuvent être triés avec des anti-ICAM-2 Dynabeads. </li></ol> 3. Préparation anti-ICAM-2 anticorps conjugués Dynabeads <ol><li> Dynabeads anti-ICAM-2 anticorps conjugués sont utilisés pour purifier davantage les cellules qui ont été sélectionnés avec des anti-PECAM-1-anticorps conjugués Dynabeads et cultivée jusqu'au confluent. Cette procédure est réalisée comme décrit pour Dynabeads anti-PECAM-1-anticorps conjugués (1, ci-dessus), sauf que l'anti-souris ICAM-2 (CD-102) anticorps est utilisé à la place de l'anti-PECAM-1 anticorps. </li><li> Dynabeads anti-ICAM-2 anticorps conjugués peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'àà 1 mois. </li></ol> 4. Le tri des cellules de poumon de la souris endothéliales avec anti-ICAM-2 Dynabeads <ol><li> Manteau T75 flacon de culture tissulaire avec 2% de gélatine. </li><li> Aspirer les médias de la confluence flacon T75 avec des cellules et laver avec 8 ml de PBS. </li><li> Aspirer le PBS, ajouter 2 ml 0,05% de trypsine / EDTA et laissez cellules se détachent (environ 5 minutes). Tap flacons légèrement pour détacher l'aide. </li><li> Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter 2 ml IM à inhiber la trypsine les cellules et gratter pour détacher les cellules adhérentes restantes. Transfert suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger pendant 5 min à 400x g. </li><li> Aspirer les médias et les cellules Resuspendre le culot dans 2 ml de 0,1% BSA / PBS. </li><li> Transférer dans un 5 ml en polystyrène à fond rond tube et ajouter 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads. Tumble pendant 12 minutes à température ambiante. </li><li> Fractionner cellules en suspension dans deux tubes de 1,5 ml Eppendorf et monter sur le MPC. </li><li> Aspirer le surnageant après perles ont adhéré pendant une minute. Retirer les tubes de MPC et resuspendre chaque tube dans 1 ml de 0,1% BSA / PBS. Remontez sur le MPC. </li><li> Répétez laver quatre fois (total de 5 lavages). </li><li> Resuspendre chaque tube avec 1 ml VL et d'effectuer un comptage des cellules. </li><li> Cellules de la plaque à 250-350K cellules par flacon T25 et / ou 750K-1 millions de cellules par flacon T75. </li><li> Amener le volume à 5 ml VL dans des flacons T25 et T75 10 ml dans des flacons. </li><li> Changer les médias tous les jours. Les cellules peuvent être utilisés pour des expériences lorsque la culture atteint environ 80% de confluence, généralement en 2-3 jours. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Généralement, après 6-7 jours de la préparation initiale des cellules, nous sommes en mesure d'obtenir environ 01.02 à 01.05 x 10 6 cellules endothéliales pulmonaires de trois chiots 6-8 jours anciens. Cellules d'affichage typique »pavées" morphologie en microscopie optique et de montrer la VE-cadhérine (CD144) à la coloration jonctions cellule-cellule, qui est caractéristique des cellules endothéliales (figure 1). La majorité des MLECs expresse VE-cadhérine et VEGFR2 comme démontré par analyse FACS (figure 2). Habituellement, nous les utilisons pour des expériences dans les deux semaines après l'isolement initial MLEC. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. L'analyse microscopique des MLEC monocouche confluente. (A) Image au microscope optique montre la morphologie des cellules cultivées pavées typiques des cellules endothéliales. Uniforme structures rondes situées dans la région périnucléaire de nombreuses cellules sont les billes magnétiques utilisées pour l'isolement MLEC. (B) endothélial spécifique VE-cadhérine est localisée au niveau des jonctions cellule-cellule comme indiqué en utilisant la microscopie confocale. Bar est représentatif de 20μm. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 analyse FACS des MLECs culture marquées avec des anticorps spécifiques pour endothéliales des marqueurs spécifiques:. VE-cadhérine (CD144) ou VEGFR2, comme inculpé, suivie par la phycoérythrine anticorps secondaire conjugué, confirme l'identité de l'endothélium MLECs isolés. La ligne rouge indique isotype-spécifiques de contrôle, la ligne verte indique anti-VE-cadhérine ou anti-VEGFR2 - spécifiques IgG.

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</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par Medical College of Wisconsin IACUC Comité en vertu du protocole AUA # 00001206.

Microvasculaire EC se sont révélés être un modèle utile dans de nombreux domaines de la biologie vasculaire et sont considérés comme physiologiquement plus pertinent d&#39;étudier (par exemple l&#39;angiogenèse) que largement étudié HUVEC 3. Auparavant, il a été rapporté que microvasculaires ECS peut être obtenu à partir de rein, cœur, peau de tissu adipeux, la rétine, le cerveau, le gliome, et aussi des poumons 2, 4-7, 10, 11. Toutefois, une méthode cohérente et fiable pour l&#39;isolement des complications microvasculaires ECS est toujours requis. La procédure présentée ici est une modification d&#39;un protocole de deux publiés antérieurement; elle diffère de la plupart des procédures publiées en ce qu&#39;elle utilise les chiots au lieu d&#39;animaux adultes. Ceci est crucial pour le succès d&#39;isolement que les cellules de jeunes animaux ont un potentiel élevé de prolifération et de cultures dérivées de leurs tissus ont tendance à donner plus grand nombre de cellules. Une semaine anciens animaux semblent être optimales mais les jeunes souris (quatre jours d&#39;âge) peuvent également être utilisés. En outre, nombre supérieur ou inférieur de chiots peut être utilisée si nécessaire, comme nous avons réussi à isoler MLECs d&#39;un chiot. Cependant, tout en réduisant le haut ou vers le bas le processus d&#39;isolement, densité de placage cellulaire doit rester inchangée, comme cela est également critique pour la prolifération cellulaire. Le processus de purification en 2 étapes du MLECs utilisant des billes magnétiques conjuguées premier anti-PECAM-1 et que les anti-ICAM-2 anticorps est beaucoup plus efficace d&#39;obtenir des cultures pures de CE que les procédures décrites précédemment de purification en une seule étape. Ce protocole élimine la nécessité d&#39;utiliser des techniques manuelles très laborieux, la centrifugation de gradient et FACS moins efficace de tri des cellules jeter polluants tels que les fibroblastes, les cellules sanguines et des cellules musculaires lisses. La population résultant MLEC peut être utilisé pour l&#39;analyse in vitro des réponses angiogéniques, la perméabilité vasculaire et la transmigration des leucocytes, la cicatrisation des plaies ainsi que l&#39;analyse biochimique des voies de signalisation. Si nécessaire, MLECs peuvent être plaqués sur différentes surfaces telles que des lamelles de fibronectine ou de la gélatine à revêtement pour les tableaux immunofluorescence ou d&#39;électrodes pour la résistance trans-endothéliale (TER) mesures. Les résultats obtenus peuvent être comparés directement aux phénotypes observés in vivo, ce qui est particulièrement important dans le contexte de l&#39;augmentation du nombre des huitièmes de finale et de lignées de souris transgéniques. Mise en œuvre réussie de cette méthode pour l&#39;analyse in vitro des mécanismes cellulaires qui sous-tendent les défauts observés in vivo, a déjà été présentée 12.

<table><tbody><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>Pincettes</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Cannule 14G</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 20 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Beads Dynabeads anti-IgG de rat</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur de particules magnétiques (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-PECAM-1 de souris (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-ICAM-2 de souris (CD-102)</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase/Dispase (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>Une solution mère à 100 mg/ml peut être préparée et conservée à -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kits complets Vasculife EnGS-Mv (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA 0,05 %</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire en nylon de 70 &amp;mu;m</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire de 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Les cellules endothéliales de fournir un modèle de recherche utiles dans de nombreux domaines de la biologie vasculaire. Depuis son premier isolement 1, des cellules endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) ont montré pour être pratique, facile à obtenir et à la culture, et sont donc les cellules endothéliales plus largement étudié. Cependant, pour des recherches axées sur les processus de l&#39;angiogenèse comme les autres, la perméabilité ou plusieurs cellules endothéliales microvasculaires (ECs) sont un modèle beaucoup plus physiologiquement pertinents pour l&#39;étude 2. Par ailleurs, EC isolées de souris knockout fournir un outil utile pour l&#39;analyse des protéines ex vivo la fonction. Plusieurs approches d&#39;isoler et de la culture microvasculaires ECs de différentes origines ont été rapportés à ce jour 3-7, mais l&#39;isolement et la culture cohérente de pure ECS est toujours un problème technique majeur dans de nombreux laboratoires. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape sur une méthode fiable et relativement simple d&#39;isoler et de cultiver des cellules de souris pulmonaires endothéliales (MLECs). Dans cette approche, les tissus pulmonaires obtenues à partir de 6 - 8 jours chiots ancienne est d&#39;abord coupé en morceaux, digérés par la collagénase / dispase (C / D) en solution et dispersés mécaniquement dans une seule cellule de suspension. MLECS sont purifiés à partir de cellules en suspension en utilisant une sélection positive avec des anti-PECAM-1 anticorps conjugué à Dynabeads utilisant un concentrateur de particules magnétiques (MPC). Ces cellules purifiées sont cultivées sur la culture de tissus enduits de gélatine (TC) plats jusqu&#39;à ce qu&#39;ils deviennent confluentes. A ce stade, les cellules sont encore purifiée en utilisant Dynabeads couplé à l&#39;anti-ICAM-2 anticorps. MLECs obtenus avec ce protocole présentent un phénotype pavées, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase, et leur phénotype endothélial a été confirmée en utilisant une analyse FACS avec des anti-VE-cadhérine 8 et anti-VEGFR2 9 anticorps et coloration par immunofluorescence de la VE-cadhérine. Dans nos mains, cette procédure d&#39;isolement en deux étapes cohérente et fiable des rendements d&#39;une population pure de MLECs, qui peut encore être cultivé. Cette méthode permettra aux chercheurs de profiter du nombre croissant de knock-out et des souris transgéniques pour une corrélation directe entre les études in vivo avec des résultats d&#39;expériences in vitro réalisées sur MLECs isolées et contribuer ainsi à révéler des mécanismes moléculaires des phénotypes vasculaires observés in vivo.

Ici, nous décrivons un protocole pour l&#39;isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d&#39;un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d&#39;origine essentiellement microvasculaires.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Les cellules endothéliales constituent un modèle de recherche utile dans de nombreux domaines de la biologie vasculaire. Depuis leur premier isolement 1, les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de cultiver des cellules endothéliales pulmonaires provenant de souriceaux néonatals. Cette étape est réalisée en premier lieu en préparant une suspension cellulaire homogène à partir de poumons fraîchement prélevés. Ensuite, le tissu est haché finement et soumis à une digestion enzymatique, puis enrichi en cellules endothéliales à l'aide de billes magnétiques conjuguées à un anticorps anti P chimiotactique un.La culture CETA purifie la population de cellules endothéliales. Ensuite, à l'aide de billes magnétiques conjuguées à un anticorps anti-I-chem-deux, ces cellules sont isolées et amplifiées dans un flacon revêtu de gélatine. Les cellules endothéliales pulmonaires primaires obtenues sont principalement d'origine microvasculaire et expriment des marqueurs spécifiques des cellules endothéliales, tels que TERRIN et VEGF R deux.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'inactivation génique par ARNi, est qu'elle permet d'utiliser des souris transgéniques afin d'obtenir des cellules endothéliales génétiquement modifiées. De plus, les cellules endothéliales obtenues par cette technique sont principalement d'origine microvasculaire et sont donc potentiellement plus pertinentes pour certains domaines de la recherche vasculaire. Les cellules endothéliales obtenues avec cette méthode peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie vasculaire, notamment celles portant sur les mécanismes moléculaires de l'angiogenèse et de la perméabilité vasculaire.La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car les étapes de digestion du prélèvement tissulaire et de lavage des cellules liées aux billes sont difficiles à maîtriser. Une exécution incorrecte de cette technique peut entraîner une contamination par des cellules non endothéliales ainsi qu’un faible rendement et une mauvaise croissance cellulaire. Pour ce protocole utilisant les billes dyna, préparez 50 millilitres de BSA à 0,1 % dans du PBS et mélangez par vortexage jusqu’à dissolution complète de la BSA, puis stérilisez la solution en la faisant passer à travers une seringue de 0,22 micron.Filtrez dans des conditions stériles sous la hotte de culture tissulaire, resuspendez les billes Dynabeads anti-IgG de rat et transférez 200 microlitres dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre. Pour laver les billes, placez le tube sur le concentrateur de particules magnétiques (MPC) et laissez les billes sédimenter pendant une minute, puis aspirez le surnageant. Retirez le tube du MPC et resuspendez les billes dans un millilitre de PBS stérile contenant 0,1 % de BSA.Répétez ce lavage trois fois supplémentaires après le quatrième lavage. Retirez le tube du MPC et du Resus. Suspendez les billes dans 500 microlitres de B-S-A-P-B-S à 0,1 %.Ajoutez 10 microlitres d'anticorps rat anti souris pcam un dans le tube et incubez deux heures en agitation à température ambiante, comme indiqué précédemment. Lavez les billes quatre fois avec du PBS stérile contenant 0,1 % de BSA. Retirez le tube du MPC et resuspendez.Les billes dans 200 microlitres de solution de B-S-A-P-B-S à 0,1 %. Cette préparation contient des billes magnétiques Dyna conjuguées à l'anticorps anti-P chem un, conservées à quatre degrés Celsius. Pour obtenir les cellules primaires, anesthésier trois souriceaux âgés de six à huit jours.Vérifiez l'efficacité de l'anesthésie en pinçant les queues avec une pince. Disséquez les animaux séquentiellement. Fixez d'abord le petit à une planche et retirez la peau de la région thoracique.Avec des ciseaux de dissection, enlever la cage thoracique afin d'exposer les poumons. Ensuite, prélever de manière aseptique les lobes pulmonaires individuels, en prenant soin de ne pas sectionner les bronches ni les tissus conjonctifs visibles autour des poumons.Combiner tous les poumons dans du DMEM glacé et euthanasier enfin les petits. Passer maintenant sous la hotte de culture tissulaire. Retirer les lobes pulmonaires du DMEM et les placer dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres.Aspirez l'excès de DMEM à l'aide de ciseaux stériles et hachez le tissu. Enfin, effectuez environ cent coupes pour la digestion enzymatique. Transférez la préparation tissulaire dans 15 millilitres de solution chaude de collagénase pour l'espace discale et incubez pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius sur un agitateur rotatif, en utilisant une seringue de 20 millilitres reliée à une canule de calibre 14, afin de dissocier les agrégats de tissu digéré en une suspension monocellulaire.Faites maintenant passer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres et rincez le tamis avec 15 millilitres de Im pour arrêter la réaction de digestion. Pour récolter les cellules pulmonaires, centrifuger à 400 G pendant cinq minutes et aspirer le surnageant. Resuspendez ensuite le culot cellulaire dans trois millilitres de PBS contenant 0,1 % de BSA et transférez dans un tube en polystyrène rond de cinq millilitres.Pour isoler les cellules endothéliales, ajouter 22,5 microlitres de billes dynamiques conjuguées à l'anticorps anti-P chimiotactique 1 et agiter à température ambiante pendant 12 minutes. Pendant ce temps, recouvrir un flacon T 75 de deux millilitres de gélatine à 2 %. Aspirer la solution de gélatine en excès et laisser sécher à l'air libre dans la hotte de culture tissulaire pendant environ une demi-heure. Une fois l'incubation des billes terminée, répartir équitablement la suspension cellulaire dans trois tubes Fendor et fixer sur le MPC.À l’aide du système MPC, lavez les billes dyna cinq fois avec environ un millilitre de PBS contenant 0,1 % de BSA. Après le dernier lavage, remettez en suspension les billes dans un millilitre de milieu VAs life par tube. Mélangez soigneusement en combinant tous les tubes. Ensuite, plaquez la préparation de cellules sur billes dyna dans un flacon T75 préalablement codé et amenez le volume total du flacon à 10 millilitres avec du milieu VAs life.Maintenant, placez les flacons dans une étuve à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu le jour suivant, laissez une journée complète de croissance, puis renouvelez la moitié du milieu tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence supérieure à 70 à 80 %. Pour purifier davantage la culture cellulaire primaire, préparez des billes Dyna conjuguées à un anticorps comme indiqué précédemment, mais cette fois en utilisant l'anticorps CD102 et Muse I chim deux.Enduire également un flacon de culture de tissus T 75 avec de la gélatine à 2 %, comme indiqué précédemment. Retirer maintenant du incubateur le flacon T 75 contenant les cellules. Aspirer le milieu et laver les cellules primaires avec huit millilitres de PBS, puis aspirer. Ajouter deux millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le PBS et laisser agir environ cinq minutes pour que les cellules se détachent. Tapoter doucement le flacon pour favoriser le détachement cellulaire. Ajouter deux millilitres de milieu de culture (IM) pour inhiber la trypsine et racler les cellules adhérentes restantes.Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Récoltez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 400 ×g, aspirez le milieu et resuspendez le culot cellulaire dans deux millilitres de PBS contenant 0,1 % de BSA. Transférez dans un tube rond en polystyrène de cinq millilitres et ajoutez 10 microlitres de billes Dynabeads anti-ICAM-2. Incubez en agitation douce pendant 12 minutes à température ambiante. Répartissez ensuite la suspension cellulaire dans deux tubes Eppendorf de 1,5 millilitre et placez-les sur le système MPC.Comme précédemment, lavez les billes avec un millilitre de PBS contenant 0,1 % de BSA, au total cinq fois. Resuspendez maintenant chaque tube dans un millilitre de milieu VAs life et effectuez un dénombrement cellulaire. Enfin, ensemencez les cellules à raison de 800 à 1000 milliers de cellules par flacon T75 dans 10 millilitres de milieu VAs life. Placez les flacons dans une étuve à culture cellulaire.Changer le milieu tous les deux jours jusqu'à ce que les cultures atteignent environ 80 % de confluence. Les cellules endothéliales pulmonaires de souris purifiées sont prêtes à être utilisées dans des expériences. Généralement, une préparation cellulaire provenant de trois souriceaux âgés de six à huit jours donne 1,2 à 1,5 × 10⁶ cellules endothéliales pulmonaires après une semaine en culture.Comme prévu, ces cellules endothéliales primaires présentent une morphologie en pavés sous microscopie optique et montrent également une coloration cohérente de la VE aux jonctions intercellulaires. À l’aide de ce protocole, la majorité des cellules endothéliales pulmonaires de souris expriment la VE cohérente et le VEGF R deux, comme le démontre l’analyse par cytométrie en flux. La ligne rouge indique le témoin spécifique à l’isotype et la ligne verte indique l’IgG spécifique anti-VE ou anti-VEGF R deux.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prélever uniquement le tissu cible, d'éviter une digestion excessive des cellules et de bien laver les cellules liées aux billes. Les cellules endothéliales obtenues peuvent être utilisées pour des tests fonctionnels dans le domaine de la biologie vasculaire afin d'analyser des réponses pertinentes pour l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des cellules endothéliales primaires de souris à l'aide d'un anticorps chimiotactique un et d'un anticorps chimiotactique deux liés à des billes dynamiques, ainsi que comment obtenir des cultures pures de cellules endothéliales.

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JoVE Journal

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Biologie

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