Name: Préparation des coupes dhippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour létude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de lamylose pathologie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Apprenez à préparer des coupes d'hippocampe chez des rongeurs âgés et des souris transgéniques pour étudier les altérations synaptiques liées au vieillissement et à la pathologie amyloïde.

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Les travaux pris en charge par NIH AG027297, un prix de la moelle épinière et le Kentucky Research Trust blessure à la tête, et un don de la Fondation Kleberg.

<ol><li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase%2Fphosphatase+activities+parallel+reduced+synaptic+strength+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging.</a> J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+and+long-term+potentiation+reversal+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging.</a> J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).</li>
<li>Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+%27zipper%27+slice+studies+reveal+a+necessary+role+for+calcineurin+in+the+increased+activity+of+L-type+Ca%282%2B%29+channels+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging.</a> Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).</li>
<li>Burke, S. N., Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+synapses+and+hippocampal+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics.</a> Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+and+modulation+of+synaptic+plasticity+in+the+aged+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain.</a> Aging Cell. 6, 319-325 (2007).</li>
<li>Foster, T. C., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+Ca%282%2B%29-dependent+processes%3A+relation+to+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity.</a> Hippocampus. 7, 602-612 (1997).</li>
<li>Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+calcium+hypothesis+of+brain+aging+and+Alzheimer%27s+disease%3A+minding+the+store%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store.</a> Aging Cell. 6, 307-317 (2007).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+amyloid+toxicity+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease.</a> J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).</li>
<li>Green, K. N., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+calcium+to+Abeta+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease.</a> Neuron. 59, 190-194 (2008).</li>
<li>Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+effects+on+the+limits+and+stability+of+long-term+synaptic+potentiation+and+depression+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1.</a> J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+age-related+alterations+in+synaptic+plasticity+by+blockade+of+L-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Scheff, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+afferent+function+and+synaptic+strength+in+hippocampal+CA1+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury.</a> J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).</li>
<li>Sama, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-dependent+signaling+between+astrocytes+and+neurons+depends+critically+on+astrocytic+calcineurin%2FNFAT+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity.</a> J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).</li>
<li>Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+large-conductance+Ca%282%2B%29-activated+K%28%2B%29+channels+depresses+basal+synaptic+transmission+in+the+hippocampal+CA1+area+in+APP+%28swe%2Find%29+TgCRND8+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice.</a> Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).</li>
<li>Bear, M. F., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity%3A+LTP+and+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity: LTP and LTD.</a> Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+hippocampal+synaptic+plasticity+in+age-related+memory+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline.</a> Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).</li>
<li>Foster, T. C., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+is+associated+with+impaired+memory+in+aged+Fischer+344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats.</a> Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).</li>
<li>Hsu, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase+and+phosphatase+activities+and+age-related+impairments+of+synaptic+transmission+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation.</a> Hippocampus. 12, 787-802 (2002).</li>
<li>Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+suppresses+expression+of+long-term+depression+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats.</a> Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).</li>
<li>Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFATs+and+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">NFATs and Alzheimer's Disease.</a> Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).</li>
<li>Abdul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+in+Alzheimer%27s+disease+is+associated+with+selective+changes+in+calcineurin%2FNFAT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling.</a> J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).</li>
<li>Anantharaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+mediated+nitration+of+manganese+superoxide+dismutase%3A+implication+for+oxidative+stress+in+a+APPNLH%2FNLH+X+PS-1P264L%2FP264L+double+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).</li>
<li>Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+a+APP%2FPS1+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease+is+impaired+in+old+but+not+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice.</a> PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).</li>
<li>Stringer, J. L., Lothman, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+extracellular+calcium+concentrations+on+hippocampal+pyramidal+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses.</a> Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).</li>
<li>Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+high+Mg2%2B-to-Ca2%2B+ratios+on+frequency+potentiation+in+hippocampal+slices+of+young+and+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats.</a> J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NA%2C+K%2C+CA%2C+MG%2C+AND+C1+CONCENTRATIONS+IN+CHOROID+PLEXUS+FLUID+AND+CISTERNAL+FLUID+COMPARED+WITH+PLASMA+ULTRAFILTRATE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE.</a> J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).</li>
<li>Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+simultaneous+emergence+of+multiple+hippocampal+biomarkers+of+aging+is+mediated+by+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).</li>
<li>Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+postsynaptic+%5BCa2%2B%5Di+and+L-type+calcium+channel+activity+in+aged+hippocampal+neurons%3A+relationship+to+impaired+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity.</a> J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).</li>
<li>Thibault, O., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+single+L-type+calcium+channels+in+hippocampal+neurons+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging.</a> Science. 272, 1017-1020 (1996).</li>
<li>Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+IP3+signaling+in+cortical+neurons+of+knock-in+mice+expressing+an+Alzheimer%27s-linked+mutation+in+presenilin1+results+in+exaggerated+Ca2%2B+signals+and+altered+membrane+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability.</a> J Neurosci. 24, 508-513 (2004).</li>
<li>Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ryanodine+receptor+recruitment+contributes+to+Ca2%2B+disruptions+in+young%2C+adult%2C+and+aged+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice.</a> J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).</li>
<li>Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-independent+long-term+depression+correlates+with+successful+aging+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats.</a> Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).</li>
<li>McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+enhancement+in+fascia+dentata%3A+cooperativity+among+coactive+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents.</a> Brain Res. 157, 277-293 (1978).</li>
</ol>

La production de cette vidéo article a été parrainé par Leica Microsystems.

Les étapes décrites dans ce protocole aidera à assurer que les dissections du cerveau sont effectués au moins aussi rapidement et efficacement en âge, comme chez les rats adultes jeunes. Nous avons aussi fournir suffisamment de détails pour le débutant de créer leur propre tranche d&#39;études sur la LTP et LTD. Si une exploration plus poussée du vieillissement et des changements AD dans la fonction synaptique et la plasticité est l&#39;un de vos objectifs, il ya au moins deux autres questions méthodologiques, évoqué ci-dessus, qui méritent un examen plus approfondi. D&#39;abord, plusieurs laboratoires ont montré que le Ca 2 +: Mg2 + ratio de l&#39;enregistrement de l&#39;ACSF peut avoir un effet marqué sur la plasticité synaptique dans l&#39;induction des coupes d&#39;hippocampe 2,10,24,25. Dans le LCR chez les mammifères, le Ca 2 +: Mg2 + taux est d&#39;environ un (voir par exemple 26). Toutefois, l&#39;ACSF Ca 2 +: Mg2 + ratios plus proche de 2 sont couramment utilisés dans les études de tranche de la fonction synaptique et la plasticité. Dans les premières études, cette pratique a probablement été adapté pour optimiser l&#39;induction de la LTP, puis est ensuite devenu la routine pour toutes les études de plasticité. Toutefois, cette pratique peut être problématique dans les études de vieillissement et AD en raison des différences bien caractérisées dans les neurones de Ca 2 + règlement. Plus précisément, l&#39;afflux de Ca 2 + et / ou Ca 2 + induite par Ca 2 +-release est élevée chez les rats âgés et / ou des souris modèles AD lors de l&#39;activation neuronale 3,27-31. L&#39;induction de LTD est particulièrement sensible aux changements subtils dans les niveaux de Ca + 2 ACSF. Notre protocole, qui utilise 2 mM de Ca 2 + et 2 mM Mg 2 +, communément traduit par LTD pour personnes âgées, mais pas de jeunes animaux adultes 2, tandis que les études utilisant une Ca 2 +: Mg2 ratio de + près de deux, ont observé LTD robustes chez les adultes dans le absence d&#39;une différence de 2,10 âge ou en conjonction avec réduction LTD chez les rats âgés 32. Ces observations soulignent la nécessité d&#39;examiner attentivement ACSF Ca 2 + et Mg 2 + lors de la comparaison des niveaux de Ca 2 +-dépendante la plasticité chez les animaux adultes jeunes et d&#39;âge. Le deuxième problème méthodologique concerne la forte dépendance de la LTP sur dépolarisation postsynaptique 33 et possibles du vieillissement / génotype des différences dans la force synaptique. Dans une expérience typique de LTP, de base et de l&#39;intensité de stimulation LTP est généralement ajustée pour produire un demi maximal (ou de trois-quarts maximale) EPSP amplitude. Le problème potentiel est que les rats âgés et APP/PS1 souris montrent habituellement réduite force synaptique par rapport à leurs homologues de type plus jeunes et / ou sauvages, ce qui signifie que les valeurs de base EPSP sera également moindre chez les rats âgés et APP/PS1 souris. Les petits RPEB peut se traduire à moins dépolarisation lors de la stimulation LTP, résultant en une probabilité réduite pour induire la LTP 33. En raison de cette confondent potentiel, il est difficile de déterminer si ces animaux présentent un déficit de débit, un déficit de plasticité, ou les deux. C&#39;est, dans les mécanismes d&#39;induction LTP âgés et / ou APP/PS1 souris peuvent être fonctionnellement intactes (pas de déficit plasticité), mais insuffisamment stimulés (déficit débit) dans ces conditions. Cette distinction est cruciale, car les mécanismes de débit et les mécanismes de la plasticité peut réagir très différemment à un traitement spécifique pharmacologique. Nous nous efforçons de minimiser l&#39;impact de débit réduit sur l&#39;induction de la LTP en normalisant l&#39;amplitude EPSP au même niveau (par exemple 1 mV) à travers toutes les tranches avant la stimulation LTP. D&#39;autres stratégies peuvent être efficaces aussi bien (par exemple l&#39;utilisation de la pince de tension ou de courant pour égaliser le potentiel de membrane entre les groupes lors de la stimulation LTP), et devrait être considéré lors des enquêtes LTP dans ces modèles animaux.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher </td><td> BP358-1 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher </td><td> BP366-500 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 (monobasique) </td><td> Sigma </td><td> P5379-100G </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 (dihydrate) </td><td> Sigma </td><td> C3306-250G </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher </td><td> S233-500 </td></tr><tr><td> C 6 H 12 O 6 (dextrose) </td><td> Fisher </td><td> BP350-1 </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Requise <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Erlenmeyer </td><td> Fisher </td><td> FB-500-2000 FB-500-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Aquarium Bulleur </td><td></td><td></td><td> Utilisé pour les médias oxygénant. Disponible dans la plupart des magasins d&#39;animaux </td></tr><tr><td> 50 ml en verre bécher </td><td> Fisher </td><td> 02-540G </td><td> Pour storarge cerveau dans l&#39;ACSF </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Fisher </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Guillotine pour petits animaux </td><td> World Precision Instruments (WPI) </td><td> PACD-M </td><td></td></tr><tr><td> Serviette en papier plat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> # 11 lames Feather chirurgicale </td><td> Fisher </td><td> 08 à 916-5B </td><td></td></tr><tr><td> Beebee Ciseaux d&#39;os </td><td> Outils Fine Science (FST) </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> Lempert Rongeurs </td><td> Roboz </td><td> RS-8321 </td><td> Utilisez pour les rats </td></tr><tr><td> Friedman-Pearson Rongeurs </td><td> TSF </td><td> 16020-14 </td><td> Utilisez pour les souris ou les rats </td></tr><tr><td> Outil de Hippocampus </td><td> TSF </td><td> 10099-15 </td><td></td></tr><tr><td> Cuillère </td><td></td><td></td><td> Une cuillère à café en plastique fera </td></tr><tr><td> Spatule </td><td> Fisher </td><td> 21 à 401-25A </td><td> Spatule </td></tr><tr><td> Chirurgical ciseaux à iris </td><td> TSF </td><td> 14058-09 </td><td></td></tr><tr><td> pipettes de transfert en plastique </td><td> Fisher </td><td> 13-711-43 </td><td></td></tr><tr><td> 110mm papier filtre Whatman </td><td> Fisher </td><td> 09-805E </td><td> Cat Whatman. 1001-110 </td></tr><tr><td> Verre de Petri </td><td> Fisher </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica VT1000P Manuel vibrant microtome </td><td> Vibratome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.1mm FA-10 S Feather lame </td><td> Ted Pella </td><td> 121-9 </td><td> 0.1mm FA-10 S Feather lame </td></tr><tr><td> Verre borosilicate Pasteur Pipet (avec poire en caoutchouc) </td><td> Fisher </td><td> 13-678-20A </td><td> Pour transférer des tranches: La pointe est cassée et polies au feu pour la plus grande ouverture </td></tr><tr><td> Boîte de 35 mm Culture Polysterine </td><td> Corning </td><td> 430588 </td><td> Utilisé pour la collecte des tranches après dissection </td></tr></tbody></table> Outils de tableau 2. Et des matériaux pour la dissection <table border="1"><tbody><tr><td> Équipement / matériel </td><td> Société </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Tenir la chambre </td><td> Custom Built </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Extracteur horizontal pipette </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td></tr><tr><td> Table d&#39;isolation vibratoire </td><td> Technique Manufacturing Corporation (TMC) </td><td></td></tr><tr><td> Cage de Faraday </td><td> Fabriquée </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex Aspirateur Bouteille avec Sidearm Bas (Produit # 1220-1L) </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Gravity-contolled mis IV avec régulateur (Produit # 2C8891) </td><td> Baxter </td><td></td></tr><tr><td> Ligne d&#39;aspiration centrale </td><td></td><td> Disponible dans la plupart des laboratoires modernes </td></tr><tr><td> 95% 2 / 5% CO 2 mélange de gaz O </td><td> Écossaist-Gross Co. </td><td></td></tr><tr><td> TygonTM Lab tube Pour O 2 / CO 2 de livraison </td><td> Fisher Scientific </td><td> Non toxique, non-oxydant, vient dans une variété de tailles. </td></tr><tr><td> Eclipse E600FN Microscope </td><td> Nikon </td><td> avec des objectifs 10x et 40x, près infrarouge filtre, et la GFP, DS-RED2 filtres </td></tr><tr><td> Refroidir Aligner ES Appareil Photo Numérique </td><td> Photometrics </td><td> Refroidir Aligner ES Appareil Photo Numérique </td></tr><tr><td> X-Cite illuminateur fluorescent </td><td> EXFO </td><td> X-Cite illuminateur fluorescent </td></tr><tr><td> Platform Microscope </td><td> Siskiyou </td><td> Personnalisé assemblés </td></tr><tr><td> RC-22 submersibles d&#39;enregistrement de chambre (Produit # 64-0228) </td><td> Warner Instruments (WI) </td><td> Nécessite P-1 adaptateur plateforme et le stade (Produit # 64-0277 De Warner) </td></tr><tr><td> Contrôleur de température TC2BIP 2/3Ch </td><td> Microcontrols cellulaire </td><td> Contrôleur de température TC2BIP 2/3Ch </td></tr><tr><td> 4 manipulateur miniature axe manuel </td><td> Siskiyou </td><td></td></tr><tr><td> Fil Iridium Platine (0,002 po) (Item # PTT0203) </td><td> WPI </td><td></td></tr><tr><td> A365 Isolateur Stimulus </td><td> WPI </td><td> A365 Isolateur Stimulus </td></tr><tr><td> Multiclamp amplificateur 700b </td><td> Axon Instruments </td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1322A convertisseur A / D </td><td> Axon Instruments </td><td></td></tr><tr><td> Logiciels pClamp </td><td> Axon Instruments </td><td></td></tr><tr><td> Personal Computer (Pentium 4) </td><td> Dell </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Équipements d&#39;électrophysiologie et de matériaux

préparation des coupes d&#39;hippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de l&#39;amylose pathologie

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

La préparation de tranches de rongeurs hippocampe est peut-être l&#39;outil le plus largement utilisé pour étudier les mammifères fonction synaptique et la plasticité. L&#39;hippocampe peut être extraite facilement et rapidement à partir de rats et de souris et de tranches de rester viables pendant des heures dans oxygénée liquide céphalorachidien artificiel. Par ailleurs, les techniques de base sont electrophysisologic facilement appliquée à l&#39;enquête de la fonction synaptique dans des coupes d&#39;hippocampe et ont fourni certains des meilleurs biomarqueurs pour des troubles cognitifs. La tranche d&#39;hippocampe est particulièrement populaire pour l&#39;étude des mécanismes de plasticité synaptique impliqués dans l&#39;apprentissage et la mémoire. Les changements dans l&#39;induction de la potentialisation à long terme et la dépression (LTP et LTD) de l&#39;efficacité synaptique dans les coupes d&#39;hippocampe (ou leur absence) sont fréquemment utilisés pour décrire le phénotype neurologique des animaux ayant une déficience cognitive et / ou pour évaluer le mécanisme d&#39;action des composés nootropique. Cet article décrit les procédures que nous utilisons pour la préparation de coupes d&#39;hippocampe de rats et de souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques associés à vieillissement du cerveau et la maladie d&#39;Alzheimer (MA) 1-3. Utilisez des rats âgés et les souris modèle AD peuvent présenter un ensemble unique de défis pour les chercheurs habitués à utiliser des jeunes rats et / ou des souris dans leurs recherches. Les rats âgés ont plus épais et plus dur crânes des tissus conjonctifs que les jeunes rats et des souris, ce qui peut retarder l&#39;extraction du cerveau et / ou de dissection et par conséquent nier ni exagérer réelles différences d&#39;âge dans la fonction synaptique et la plasticité. Le vieillissement et la pathologie amyloïde peut également exacerber les dommages subis pendant l&#39;hippocampe à la procédure de dissection, encore une fois toute complication conclusions tirées de l&#39;évaluation physiologique. Ici, nous discutons des mesures prises pendant la procédure de dissection afin de minimiser ces problèmes. Exemples de réponses synaptiques acquis en «bonne santé» et «malsain» tranches de rats et de souris sont fournis, ainsi que le représentant des expériences plasticité synaptique. L&#39;impact possible d&#39;autres facteurs méthodologiques sur la fonction synaptique dans ces modèles animaux (par exemple composants solution d&#39;enregistrement, les paramètres de stimulation) sont également discutés. Bien que l&#39;accent de cet article est sur l&#39;utilisation des rats âgés et les souris transgéniques, les novices pour trancher la physiologie devrait trouver suffisamment de détails ici pour obtenir commencé sur leurs propres études, en utilisant une variété de modèles de rongeurs.

Cet article décrit les procédures pour la préparation de coupes d&#39;hippocampe de rats et de souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques associés au vieillissement du cerveau et liée à l&#39;âge des maladies neurodégénératives comme la maladie d&#39;Alzheimer.

Préparation des coupes d&#39;hippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de l&#39;amylose pathologie

La préparation de coupes hippocampiques de rongeurs est peut-être l'outil le plus largement utilisé pour étudier la fonction et la plasticité synaptiques chez les mammifères. Le ...

Les tranches hippocampiques de rongeurs sont fréquemment utilisées pour l'étude de la fonction et de la plasticité synaptiques chez les mammifères. Nous décrivons ici un protocole permettant d'obtenir et d'étudier des tranches de rats et de souris âgés, qui possèdent un crâne plus épais et des tissus conjonctifs plus résistants que les jeunes rats et souris. Ces caractéristiques peuvent retarder l'extraction ou la dissection du cerveau, et par conséquent annuler ou exagérer les véritables différences liées à l'âge dans la fonction et la plasticité synaptiques.En outre, le vieillissement et la pathologie amyloïde peuvent aggraver les lésions hippocampiques subies au cours de la procédure de dissection, compliquant davantage les inférences tirées de l'évaluation physiologique. Dans cette démonstration, nous décrivons les mesures prises pendant les procédures d'extraction et de dissection afin de minimiser ces problèmes. Premièrement, le cerveau est rapidement extrait et placé dans un liquide céphalorachidien artificiel froid, contenant peu de calcium et mis sur de la glace.Les hippocampes sont ensuite délicatement prélevés sur un plateau de dissection glacé, et des tranches hippocampiques sont préparées à l’aide d’un vibrotome et incubées dans un liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) contenant du calcium et oxygéné. Enfin, des potentiels et des courants synaptiques sont induits dans plusieurs sous-régions hippocampiques et enregistrés ; les résultats obtenus démontrent les effets du vieillissement et/ou d’une pathologie de type Alzheimer sur la fonction et la plasticité synaptiques. Une utilisation adéquate de cette technique a des implications pour la compréhension du déclin cognitif lié à l’âge et de la démence associée à la maladie d’Alzheimer.Cela s'explique par le fait que le dysfonctionnement synaptique fait partie des biomarqueurs les plus précoces de ces symptômes cliniques, comme le démontre cette procédure. Aujourd'hui, ce sera le Dr Chris Norris, le chercheur principal du laboratoire, à côté d'un grand évier. Préparez la zone de dissection pour l'ablation du cerveau et la dissection de l'hippocampe.Inclure une serviette en papier pliée, une lame de scalpel numéro 11, des ciseaux BB, des pinces à os, et un outil pour hippocampe, une spatule double spécialisée provenant de matériel chirurgical fin. Placer également des petites ciseaux chirurgicaux, une spatule fine, une pipette en plastique, du papier filtre Whatman, une boîte de Pétri en verre de 100 millimètres remplie de glace, une cuillère en plastique et un bécher contenant une solution de calcium libre partiellement décongelée. Un LCR recouvert de paraffine.Après la décapitation du rat, le cerveau doit être extrait le plus rapidement possible. Placez la tête sur la serviette en papier et, à l’aide du scalpel, pratiquez rapidement une incision au milieu du cuir chevelu, depuis l’os nasal jusqu’à l’os occipital.Veillez à couper complètement le muscle cutané, exposant ainsi entièrement les sutures du crâne. Maintenez fermement la tête et sectionnez les plaques occipitale, pariétale et frontale le long de la suture médiane. Assurez-vous de garder la lame inférieure des ciseaux fermement appuyée contre la surface interne du crâne et éloignée du cerveau.Ceci est essentiel pour éviter tout éraflage accidentel. Diapositive suivante. Insérez les mandibules du rongeur sous la plaque pariétale gauche et serrez les mâchoires ensemble, en roulant vers le haut et vers l'avant pour écarter les plaques pariétale et occipitale.Si nécessaire, utilisez les pinces de Ron pour retirer également la plaque frontale gauche. Répétez l'opération pour l'autre hémisphère. Une fois les plaques déplacées, utilisez les pinces de Ron ou des ciseaux pour retirer délicatement ou couper toute dure-mère qui pourrait être attachée aux plaques temporales et s'étendre à la surface du cerveau.Faites maintenant glisser les pinces de type Ron entre le cerveau et la plaque temporale droite, en exerçant une pression vers le crâne et en s'éloignant du cerveau. Serrez et tournez la plaque temporale jusqu'à ce qu'un craquement soit entendu ou ressenti. Répétez l'opération du côté gauche.Faites glisser la spatule large devant l'instrument hippocampique entre la surface ventrale du cerveau et la plaque osseuse inférieure du crâne jusqu'à ce qu'elle se trouve entièrement sous le cerveau. Déplacez-la latéralement de côté à côté, ainsi qu'en avant et en arrière plusieurs fois, afin de sectionner les nerfs crâniens encore intacts à l'aide de l'instrument hippocampique. Soulevez le cerveau et immergez-le dans une solution de RAC sans calcium contenant du Parfum, puis laissez-le refroidir environ une minute.Pour extraire les hippocampes, utilisez une cuillère pour retirer le cerveau du LCR et placez-le sur du papier Watman humidifié avec du LCR, posé sur le couvercle d'une boîte de Pétri froide. À l'aide de la lame de scalpel, retirez le cervelet et environ un quart des lobes frontaux rostraux. Découpez ensuite la scissure interhémisphérique pour séparer complètement les deux hémisphères.Placer un hémisphère dans la mixture de LCR et positionner l'autre sur la platine de dissection de manière à ce que le plan coronal du lobe frontal soit orienté vers le bas ; le tronc cérébral blanc et le mésencéphale doivent être facilement distinguables du cortex recouvrant rose ou grisâtre. Localiser les colliculus sur le mésencéphale. Ceux-ci apparaîtront comme deux bourrelets blancs situés au sommet du cerveau.Dans cette orientation, maintenez délicatement le mésencéphale en place avec des ciseaux et glissez la spatule entre les corps calleux et le cortex. Ensuite, tirez doucement le tronc cérébral, le mésencéphale et le thalamus. Il se peut qu'il soit nécessaire de couper les tissus conjonctifs ou les vaisseaux sanguins avec les ciseaux.Utilisez le bord tranchant de la spatule pour sectionner le fornix, un faisceau de fibres blanc situé à la partie dorsale antérieure de l'hippocampe. Avec les ciseaux, continuez délicatement à tirer le tronc cérébral, le mésencéphale et le thalamus sans les détacher complètement du reste du cerveau.Les fibres blanches qui forment une hyperbole peu profonde à la base de l'hippocampe doivent maintenant être visibles dans cette orientation. À l’aide de la pipette de transfert, pulvériser doucement un peu de LCR dans l’espace situé sous la FIA afin de faciliter la séparation de l’hippocampe par rapport au cortex. Glisser délicatement la spatule dans cet espace et, tout en maintenant fermement le tronc cérébral, le mésencéphale et le thalamus avec les ciseaux, rouler doucement l’hippocampe et retirer les restes de cortex, vaisseaux sanguins et substance blanche qui y adhèrent encore.Rincez avec quelques millilitres de LCS A. À l’aide de la pipette de transfert, maintenez le tissu humide et froid avec une mixture pâteuse de LCS. Ensuite, retirez l’autre hémisphère et répétez la dissection pour sectionner les hippo Campi du rat.Remplissez le réservoir du vibrotome avec du LCR artificiel glacé, sans calcium, de manière à ce que le plateau de coupe et la lame soient entièrement immergés. Utilisez un scalpel pour sectionner les extrémités rostrale et caudale de chaque hippocampe, puis placez-les ensemble, appuyés sur leurs surfaces rostrales, de sorte que le gyrus denté de chaque hippocampe soit tourné vers l'autre. Collez le tissu cérébral sur un bloc de fixation et transférez-le sur le plateau de coupe du vibrotome.Pour les expériences de physiologie synaptique, des sections de 400 micromètres sont recommandées. À l’aide d’une pipette de transfert à embout large, transférez les tranches dans une petite boîte de Pétri contenant une solution artificielle du liquide céphalorachidien (CSF) sans calcium et froide.Une fois la section terminée, les tranches sont transférées dans une chambre de conservation remplie d'ACSF contenant du calcium et oxygénée. Porter progressivement la chambre de 27 à 32 degrés Celsius afin d'effectuer des enregistrements extracellulaires de base. Dans les tranches aiguës, la chambre d'enregistrement est disposée sur la platine du microscope, de sorte que l'ACSF préchauffée est acheminée par gravité à travers un régulateur de débit et évacuée par une ligne de vide centrale.À l’aide d’un petit pinceau, transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement afin qu’elle soit immergée dans du LCR A et repose sur le filet inséré. Laissez la tranche s’acclimater pendant 10 à 15 minutes. Pendant que la tranche s’acclimate, allumez le stimulateur ou l’isolateur de stimulus et réduisez la sortie à zéro.Ensuite, positionnez une électrode de stimulation au-dessus de la tranche dans la région du stratum radiatum du CA2 près de la limite du CA3. Abaissez l'électrode d'enregistrement dans le stratum radiatum du CA1 en perçant légèrement la surface de la tranche. Augmentez la sortie du stimulateur à un niveau modéré ici.L'isolateur de stimulus est réglé à environ 150 microampères. Abaissez lentement l'électrode de stimulation par petits intervalles jusqu'à ce qu'un artefact de stimulus soit enregistré. Dans le cas du CA un, continuez à abaisser lentement à la fois les électrodes de stimulation et d'enregistrement par intervalles tout en acquérant les réponses du CA un.Jusqu'à ce que les amplitudes du vol de fibre et du potentiel postsynaptique excitateur atteignent des niveaux maximaux à l'aide d'un programme d'acquisition tel que Clampex, établissez une courbe de force synaptique. Utilisez ensuite le logiciel pour délivrer des stimulations à diverses intensités et enregistrer l'activité correspondante dans ca un. La gamme et le nombre de niveaux d'intensité de stimulation utilisés doivent être suffisants pour générer une courbe sigmoïde lorsqu'ils sont tracés par rapport aux valeurs de FV ou de EPSP.Ensuite, pour étudier la plasticité synaptique, réinitialisez l'intensité du stimulus pour chaque tranche de manière à obtenir une réponse d'un millivolt. Commencez la stimulation de base à une fréquence de 0,033 hertz pour le PSEP. Les valeurs de pente doivent rester stables pendant au moins 20 minutes avant l'induction de la potentialisation à long terme (LTP) ou de la dépression à long terme (LTD).Pour enregistrer une période de base, utilisez un fichier de paramètres clamp X afin de stimuler et d'enregistrer toutes les 30 secondes. Ensuite, pour induire la PPF, ouvrez un fichier de paramètres distinct permettant d'induire la PPF à l'aide d'un train d'une seconde de stimulation à 100 hertz ou de plusieurs brèves salves de stimulation à 200 hertz délivrées toutes les 200 millisecondes pour l'induction de la DP. Appliquez 900 impulsions de stimulation à une fréquence d'un hertz.Une fois que les trains de stimulation reviennent au fichier de paramètres de base, enregistrer les réponses synaptiques pendant 60 minutes ou plus. Comparer les valeurs de la pente du PSE obtenues avant et 60 minutes après la stimulation à haute ou basse fréquence afin de déterminer la présence d'un PTP, indiqué par une augmentation de la force synaptique, ou d'un DLT, indiqué par une diminution de la force synaptique. On pense largement que ces deux processus reflètent des mécanismes essentiels pour l'apprentissage et la mémoire.Ici, des courbes représentatives de la force synaptique provenant de deux tranches hippocampiques différentes issues de deux souris A PP PS.One sont présentées. Une souris a été traitée avec un nouveau réactif viral adéno-associé anti-inflammatoire. L'autre a été traitée avec un réactif viral contrôlé.Comme on peut le constater lorsqu'un nombre similaire de fibres présynaptiques est activé entre les différentes conditions expérimentales. Lorsque les groupes présentent des amplitudes de FV semblables, indiquées sur l'axe des x, la courbe du tranché traité au réactif a est décalée vers la gauche, ce qui indique des amplitudes de PPSÉ plus élevées. Ces données montrent que la force synaptique basale est plus importante dans le tranché traité au réactif a.Voici les résultats d'expériences de PPL réalisées sur les mêmes tranches. Notez que les valeurs de la pente du PPSÉ dans la tranche avec le réactif A sont nettement plus élevées par rapport à la tranche témoin pendant l'heure de base suivant l'application d'une stimulation à 100 hertz, indiquant la présence de PPL dans la tranche avec le réactif A mais pas dans la tranche témoin. Cette figure montre l'aspect des formes d'onde du PPSÉ dans les tranches de souris avec le réactif A et témoins avant et 60 minutes après l'application d'une stimulation à 100 hertz.L'augmentation de la pente du PSEP après la période de 100 hertz est très évidente dans la tranche traitée au réactif A, ce qui est indicatif d'un PPL. Les expériences présentées dans les figures jusqu'ici indiquent que le réactif A augmente la force synaptique et améliore les déficits de PPL. Chez des souris PP PS un, des expériences similaires ont été réalisées sur des LACS hippocampiques provenant de rats âgés.Ici, les courbes de force synaptique provenant de deux tranches hippocampiques différentes, issues d'un rat traité avec un nouveau médicament anti-inflammatoire et d'un autre rat traité avec un réactif contrôle véhicule, sont présentées. Remarquez que ces courbes sont très similaires pour les deux tranches, ce qui indique que le médicament A a peu d'effet sur la force synaptique basale. Cette figure montre les résultats d'expériences de LTD réalisées sur les mêmes tranches.Remarquez que, typique des rats âgés, les valeurs de la pente du PEPS dans la tranche traitée au véhicule sont déprimées durant la période de base d'une heure suivant l'application d'une stimulation à un hertz. Toutefois, les valeurs de la pente du PEPS dans la tranche traitée au médicament A montrent peu ou pas de dépression, indiquant l'absence de DLT. Les formes d'onde du PEPS provenant des tranches de rats traités au médicament A et au véhicule, avant et 60 minutes après l'application d'une stimulation à un hertz, sont présentées ici. La diminution de la pente du PEPS pendant la période post-stimulation à un hertz est très évidente dans la tranche au véhicule, mais pas dans la tranche au médicament A prise ensemble.Les résultats présentés dans ces figures montrent que le médicament a améliore les différences de plasticité chez les rats âgés en bloquant l'induction de la DLT, mais n'affecte pas la fonction synaptique basale. Ces données indiquent que plusieurs paramètres de la fonction synaptique et de la plasticité chez les rats âgés et les souris modèles d'Alzheimer peuvent être modulés par des traitements expérimentaux, et soulignent l'utilité des tranches hippocampiques aiguës pour étudier le potentiel nootropique et/ou neuroprotecteur de nouveaux médicaments ou réactifs expérimentaux. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien équilibrer la rapidité d'extraction du cerveau avec la précision et la délicatesse requises lors de la dissection, de la sectionnement et de la manipulation de l'hippocampe destiné à des mesures électrophysiologiques.

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