JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 1:30 min • March 4th, 2025
Commencez par une tranche de cerveau coronaire préfixée, déparaffinisée et réhydratée contenant des neurones subissant une apoptose, caractérisée par la mort cellulaire et la fragmentation de l’ADN.
Pour détecter la mort cellulaire apoptotique à l’aide du test TUNEL, traitez la tranche de cerveau avec l’enzyme protéinase-K.
La protéinase-K pénètre dans les neurones et inactive les DNases, empêchant ainsi la dégradation de l’ADN.
Rincez la tranche pour éliminer les enzymes résiduelles.
Ajoutez un tampon contenant des désoxyuridine triphosphates marqués par fluorescence, ou dUTP, et la désoxynucléotidyltransférase terminale, ou enzyme TdT, puis incuberez.
Dans les neurones apoptotiques avec des fragments d’ADN abondants, l’enzyme TdT attache ces dUTP fluorescents aux groupes 3′-hydroxyles libres des fragments d’ADN.
En revanche, l’ADN des neurones sains n’est pas étiqueté.
Teindre le tissu avec du DAPI, un colorant nucléaire qui se lie à l’ADN dans les neurones sains et apoptotiques, colorant leurs noyaux en bleu.
Lors de la visualisation, les neurones contenant à la fois une fluorescence bleue et verte confirment la mort cellulaire apoptotique dans le tissu cérébral.