Préparation de coupes de cerveau de rat pour l’analyse au microscope électronique de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique

Prenez un rat soumis à un flux sanguin restreint vers l’hémisphère droit du cerveau, entraînant des dommages à la BHE.

Injectez par voie intraveineuse de l’albumine marquée au fluorophore, qui traverse la BHE endommagée et atteint le cerveau.

Obtenez des sections cérébrales fixées chimiquement.

Ajoutez un tampon de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Appliquez des anticorps conjugués à la peroxydase ciblant l’albumine marquée au fluorophore.

Ajoutez un substrat chromogène, que la peroxydase convertit en un précipité dense en électrons.

Introduire du tétroxyde d’osmium pour fixer les lipides membranaires et améliorer le contraste.

Déshydratez les sections avec des concentrations d’alcool croissantes.

Ajoutez de l’acétate d’uranyle, qui se lie aux acides nucléiques et aux protéines pour augmenter le contraste.

Déshydrater à nouveau avec des concentrations d’alcool croissantes, en terminant par de l’oxyde de propylène pour l’enrobage de résine. Intégrez les sections dans de la résine.

Identifier et exciser au microscope les régions colorées par les chromogènes.

Réintégrez ces sections dans la résine et préparez des tranches ultra-fines.

Montez les tranches sur des grilles de microscopie électronique (EM).

Colorer avec du citrate de plomb pour améliorer le contraste de la matrice extracellulaire.

Procéder à l’EM pour examiner l’intégrité de la BHE.