JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 1:22 min • March 4th, 2025
Prenez l’homogénat de tissu d’un cerveau de mammifère qui contient à la fois des protéines prions normales et des agrégats de prions mal repliés responsables de maladies neurodégénératives.
Incuber avec une enzyme protéolytique pour digérer les prions normaux, en laissant intacts les agrégats résistants.
Traitez les agrégats avec un tampon dénaturant à haute température pour linéariser les protéines et leur conférer une charge négative uniforme.
Chargez l’échantillon sur un gel d’électrophorèse et séparez les protéines en bandes, ce qui confirme la présence d’agrégats.
À l’aide d’un champ électrique, transférez les protéines séparées sur une membrane.
Incuber la membrane dans une solution bloquante pour masquer les sites de liaison non spécifiques.
Incuber avec des anticorps marqués à l’enzyme peroxydase, qui se lient spécifiquement aux agrégats de prions.
Lavez la membrane pour éliminer les anticorps non liés, minimisant ainsi les signaux non spécifiques.
Ajoutez un substrat chimiluminescent et un agent oxydant, permettant à la peroxydase d’oxyder le substrat et de produire de la lumière.
Mesurez l’intensité lumineuse pour quantifier les prions mal repliés dans l’homogénat.