Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
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Commencez par une culture primaire du mésencéphale à partir d’embryons de rats, contenant des neurones dopaminergiques qui surexpriment l’alpha-synucléine mutée.
Remplacer le milieu des puits de traitement par un milieu frais contenant la substance d’essai, et celui des puits de contrôle par un milieu ordinaire. Puis incuber.
Dans le contrôle, l’alpha-synucléine forme des agrégats toxiques dans les neurones dopaminergiques, provoquant une rétraction des neurites et conduisant à la mort neuronale.
Dans le traitement, le composé testé interagit avec l’alpha-synucléine, empêche son agrégation, préserve la structure neurite et fournit une neuroprotection.
Fixez et perméabilisez les cellules, puis bloquez les sites de liaison non spécifiques.
Incuber avec des anticorps primaires pour marquer tous les neurones, avec un marquage supplémentaire pour les neurones dopaminergiques.
Lavez les cellules et ajoutez des anticorps secondaires marqués au fluorophore spécifiques aux anticorps primaires.
À l’aide d’un microscope à fluorescence inversée, comptez les neurones dopaminergiques marqués différentiellement, puis passez à un microscope confocal pour mesurer la longueur des neurites.
Un nombre plus élevé de neurones dopaminergiques avec des neurites intacts dans le traitement par rapport aux témoins confirme le potentiel neuroprotecteur du composé testé.