Manipulation optogénétique de circuits neuronaux pour la transition du sommeil à l’éveil chez la souris

Fixez une souris anesthésiée avec un crâne exposé dans un cadre stéréotaxique.

Le noyau cérébral de la strie terminale (BNST) contient des neurones transduits par le virus exprimant des canaux cationiques sensibles à la lumière.

Percez des trous dans le crâne, insérez des fibres optiques et fixez-les avec des vis de support et du ciment dentaire.

Percez des trous supplémentaires pour positionner un ensemble contenant des électrodes d’électroencéphalographie (EEG) et d’électromyographie (EMG) et fixez-le avec de l’adhésif.

Exposez les muscles du cou pour insérer les fils d’électrodes EMG, puis permettez la récupération.

Connectez la souris à un système d’enregistrement, placez-la dans une chambre d’expérimentation et laissez-la dormir.

Diffusez de la lumière à travers la fibre optique pour activer les canaux cationiques sensibles à la lumière, déclenchant un afflux de cations qui génère des potentiels d’action.

Les signaux se propagent dans les régions régulatrices du sommeil et favorisent l’éveil.

Enregistrez les signaux EEG pour surveiller l’activité cérébrale et les signaux EMG pour détecter l’activité musculaire afin d’observer la transition du sommeil à l’éveil.

Pour l’électroencéphalogramme (EEG) et l’implantation d’électrodes par électromyogramme (EMG), soudez d’abord deux fils d’acier inoxydable dont un millimètre d’isolant a été dénudé des deux extrémités aux électrodes EMG et placez le centre des électrodes sur le bregma. Marquez ensuite la position de chaque électrode EEG.

Pour déterminer la position de l’implant de fibre optique, fixez une virole en fibre optique au manipulateur et faites pivoter le bras du manipulateur à un angle de plus ou moins 30 degrés contre une ligne horizontale. Placez l’embout de la fibre sur le bregma et notez les coordonnées. Déplacez la pointe sur la ligne d’insertion ciblée et marquez la position sur le crâne et la position de la vis d’ancrage à côté du site d’insertion.

Utilisez la perceuse dentaire pour percer le crâne à chaque endroit et utilisez le manipulateur pour insérer doucement la fibre optique jusqu’à ce qu’elle atteigne au-dessus du BNST. La virole doit reposer sur le crâne restant. Fixez la fibre au crâne à l’aide d’une vis d’ancrage, en prenant soin de ne pas casser la dure-mère ni d’endommager les tissus.

Ensuite, couvrez la fibre et vissez-la avec du ciment dentaire photodurcissable. Ensuite, percez des trous pour les électrodes EEG/EMG et insérez la pointe de la première électrode dans un trou. En tenant l’implant d’une main, appliquez un adhésif cyanoacrylate dans l’espace entre le crâne et l’électrode et insérez l’électrode le reste du chemin, en prenant soin de ne pas endommager les tissus.

Lorsque toutes les électrodes ont été placées, couvrez la circonférence des électrodes et des fibres optiques avec un adhésif cyanoacrylate supplémentaire et un accélérateur cyanoacrylate pour éviter de provoquer une interruption au niveau de la virole du câble optique et de l’électrode aux zones de connexion du fil conducteur. Exposez maintenant les muscles du cou et insérez les fils de l’électrode EMG sous le muscle. Ajustez la longueur de l’électrode EMG de manière à ce qu’elle s’adapte juste sous les muscles nucaux et remplissez les implants avec plus d’adhésif cyanoacrylate et d’accélérateur.

Placez ensuite la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la compensation complète. Pour la surveillance EEG/EMG pendant la photo-excitation des neurones ciblés, utilisez d’abord un scalaire pour ajuster l’intensité du laser et utilisez une virole pour attacher la pointe du câble laser à une fibre optique inutilisée. Vérifiez qu’il n’y a pas d’espace à la jonction entre la fibre et le câble.

Après 20 minutes, émettez le laser réchauffé sur le vérificateur d’intensité et ajustez l’intensité à 10 milliwatts par millimètre carré. Réglez la durée de l’impulsion lumineuse sur 10 millisecondes, la période de repos sur 40 millisecondes, le cycle sur 20 et la répétition sur 20. Passez le mode laser à la logique à transistors et vérifiez que les impulsions lumineuses sont émises par la fibre contrôlée par le régulateur de motif.

Connectez l’électrode implantée et l’adaptateur de câble, puis couvrez la jonction avec un matériau imperméable à la lumière pour éviter les fuites laser. Et lorsque le laser est prêt, déplacez les souris dans la chambre expérimentale pour l’enregistrement EEG/EMG. Pour évaluer la latence jusqu’à l’éveil à partir de mouvements oculaires non rapides ou de sommeil oculaire rapide, limitez le temps d’enregistrement et optimisez le temps de gain du site et laissez les souris se déplacer librement dans la chambre expérimentale pendant au moins une heure.

Pendant la période expérimentale, surveillez les signaux EEG et EMG sur le même écran d’enregistrement. Évaluez l’état de la souris comme l’état d’éveil, le sommeil à mouvements oculaires non rapides ou le sommeil à mouvements oculaires rapides à l’aide de la commande de gain pour chaque onde afin de distinguer facilement chaque état. Pour mesurer la latence du sommeil à l’éveil des mouvements oculaires non rapides, observez le sommeil stable des mouvements oculaires non rapides pendant 40 secondes, puis allumez le générateur de motifs pour la photostimulation et confirmez l’émission laser aux fibres optiques implantées.

Enregistrez ensuite les signaux EEG/EMG jusqu’à ce que l’état de sommeil passe à l’état d’éveil.