Transduction lentivirale de cellules progénitrices neurales pour la régulation épigénétique de l’expression de l’alpha-synucléine

Décongeler les cellules progénitrices neurales ou NPC stockées avec un cryoprotecteur dans un bloc thermique.

Ces NPC expriment une augmentation de l’alpha-synucléine, un facteur clé de la maladie de Parkinson.

Transférez les cellules décongelées dans un tube contenant un milieu basal chaud pour diluer le cryoprotecteur.

Centrifuger pour granuler les cellules, éliminer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans les milieux neuronaux.

Ajoutez la suspension cellulaire sur une plaque multipuits revêtue d’ECM et incubez pour permettre l’adhésion et la prolifération des cellules.

Ajoutez des vecteurs lentiviraux contenant de l’ARN guide, de la méthyltransférase Cas9-DNA désactivée et un gène de résistance aux antibiotiques.

Incuber pour faciliter l’entrée virale, la transcription inverse de l’ARN viral, l’intégration dans le génome de l’hôte et l’expression du transgène.

L’ARN guide dirige dCas9 vers le gène de l’alpha-synucléine, où la méthylation de l’ADN médiée par la méthyltransférase réduit l’expression de l’alpha-synucléine.

Remplacez le milieu par un milieu neural contenant un antibiotique pour sélectionner les cellules transduites, tandis que les cellules non transduites subissent l’apoptose.

Placez un flacon cryogénique avec MD NPC dans un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius pendant deux minutes et transférez les cellules décongelées dans un tube conique de 15 millilitres avec 10 millilitres de DMEM-F12 chaud.

Centrifuger à 300 g pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et mettez à nouveau les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu N2B2 complet préchauffé. Ajoutez deux millilitres de N2B27 à la suspension cellulaire et plaquez deux millilitres de cellules dans chaque puits de la plaque à six puits revêtue de BMM préalablement préparée.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % CO_2 pendant la nuit. Lorsque les NPC MD sont à 70 % de confluence, transduisez-les en ajoutant deux microlitres de vecteurs ARN guide lentivirus d-Cas9-DNMT3A et faites tourner doucement la plaque. Après avoir incubé les cellules dans les mêmes conditions que précédemment pendant 16 heures, remplacez le milieu N2B27 48 heures après la transduction.

Ajouter N2B27 avec cinq microgrammes par millilitre de puromycine