Transduction lentivirale de cellules progénitrices neurales pour la régulation épigénétique de l’expression de l’alpha-synucléine

Décongeler les cellules progénitrices neurales ou NPC stockées avec un cryoprotecteur dans un bloc thermique.

Ces NPC expriment une augmentation de l’alpha-synucléine, un facteur clé de la maladie de Parkinson.

Transférez les cellules décongelées dans un tube contenant un milieu basal chaud pour diluer le cryoprotecteur.

Centrifuger pour granuler les cellules, éliminer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans les milieux neuronaux.

Ajoutez la suspension cellulaire sur une plaque multipuits revêtue d’ECM et incubez pour permettre l’adhésion et la prolifération des cellules.

Ajoutez des vecteurs lentiviraux contenant de l’ARN guide, de la méthyltransférase Cas9-DNA désactivée et un gène de résistance aux antibiotiques.

Incuber pour faciliter l’entrée virale, la transcription inverse de l’ARN viral, l’intégration dans le génome de l’hôte et l’expression du transgène.

L’ARN guide dirige dCas9 vers le gène de l’alpha-synucléine, où la méthylation de l’ADN médiée par la méthyltransférase réduit l’expression de l’alpha-synucléine.

Remplacez le milieu par un milieu neural contenant un antibiotique pour sélectionner les cellules transduites, tandis que les cellules non transduites s