Injection de cellules progénitrices neurales fluorescentes dans des organoïdes cérébraux humains pour la modélisation de la transplantation
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:40 min • August 29th, 2025
Commencez par des cellules progénitrices neurales ou NPC dérivées de cellules souches pluripotentes induites marquées par fluorescence.
Remettez les cellules en suspension dans un hydrogel à matrice extracellulaire pour créer un mélange uniforme de matrice cellulaire.
Incuber le mélange sur de la glace.
Ensuite, transférez un organoïde cérébral humain dans une boîte.
Retirez l’excédent de milieu et placez la parabole sous un microscope pour la procédure d’injection.
Versez le mélange cellule-matrice sur une lame de verre stérile pré-réfrigérée et aspirez-le à l’aide d’une seringue pré-réfrigérée.
Injectez lentement le mélange sur la surface de l’organoïde pour minimiser la perturbation des tissus.
Laissez reposer brièvement l’organoïde, puis ajoutez le milieu, transférez l’organoïde dans une plaque multi-puits et incuberez.
L’hydrogel se solidifie, ancrant les NPC au site d’injection. Suivez les PNJ à l’aide de la microscopie à fluorescence.
Au fil du temps, les NPC prolifèrent et migrent vers des régions éloignées de l’organoïde, où ils se différencient en neurones immatures et matures.
Cela permet une greffe cellulaire fiable avec une perturbation minimale des organoïdes, adaptée à la thérapie cellulaire neurale.
Commencez par retirer de la glace la suspension unicellulaire de cellules souches pluripotentes induites ou de cellules progénitrices neurales dérivées d’iPSC, ou NPC, et faites-les centrifuger à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius.
Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 3 milligrammes par millilitre de matrice de membrane basale solubilisée pour obtenir un volume final de deux microlitres par injection. Remettez immédiatement la suspension sur la glace jusqu’à utilisation. Transférez la seringue pré-réfrigérée du congélateur à 20 degrés Celsius dans un seau à glace pour une utilisation ultérieure.
Ensuite, retirez la plaque d’organoïde cérébral de l’incubateur et transférez-le dans une boîte de 35 millimètres à l’aide d’une pointe à large alésage. Pour stabiliser les organoïdes et faciliter l’injection, retirez le milieu autant que possible sans endommager l’organoïde. Placez la parabole de 35 millimètres contenant l’organoïde sous un microscope à dissection pour faciliter l’injection.
Une fois que les organoïdes sont prêts à être injectés, remettez doucement en suspension les cellules NPC marquées à l’EGFP à l’aide d’une pointe de pipette P20 réfrigérée, et déplacez deux microlitres de ces cellules sur une lame de verre stérile pré-refroidie. Prenez une seringue à insuline préremplie dans la glace et aspirez lentement les 2 microlitres de suspension cellulaire avec le biseau de l’aiguille vers le bas. Ouvrez le couvercle de la boîte contenant l’organoïde avant de braquer le microscope sur celui-ci.
Tenez le plat d’une main, placez le biseau de l’aiguille vers le haut. Et de l’autre main, injectez lentement la cellule dans la surface de l’organoïde. Après avoir injecté les cellules, remettez le couvercle dans la boîte et incubez l’organoïde injecté pendant une à deux minutes.
Ensuite, ajoutez doucement 500 microlitres de milieu organoïde à la plaque avant de transférer l’organoïde dans une plaque à 24 puits avec une pointe à large alésage. Incuber l’organoïde à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec un changement complet de milieu tous les deux jours.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'injection de cellules progénitrices neuronales dérivées de cellules souches pluripotentes induites, marquées au fluorochrome (NPCs), dans des organoïdes cérébraux humains. Cette technique minimise la perturbation tissulaire et permet une greffe cellulaire efficace, essentielle pour la thérapie par cellules neuronales.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie des cellules souches
- Thérapie cellulaire
Contexte
- Les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) peuvent se différencier en divers types cellulaires.
- Les cellules progénitrices neuronales (NPCs) sont essentielles au développement et à la réparation du cerveau.
- Les organoïdes cérébraux humains servent de modèles pour l'étude du développement cérébral.
- Des techniques efficaces de transplantation cellulaire sont nécessaires pour les applications thérapeutiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour injecter des cellules progénitrices neuronales (NPC) dans des organoïdes cérébraux.
- Suivre le comportement des NPC après injection à l’aide de la microscopie à fluorescence.
- Évaluer la viabilité et l’intégration des NPC au sein de l’organoïde.
Méthodes utilisées
- Préparation de cellules progénitrices neuronales à partir de cellules souches pluripotentes induites et mise en suspension dans un hydrogel.
- Injection du mélange cellules-matrice dans l'organoloïde à l'aide d'une seringue prérefroidie.
- Surveillance de la prolifération et de la migration des cellules progénitrices neuronales au sein de l'organoloïde.
- Incubation de l'organoloïde dans des conditions contrôlées après l'injection.
Résultats principaux
- Les CPN se sont intégrées avec succès dans l'organoïde avec une perturbation minimale.
- La microscopie à fluorescence a confirmé la prolifération et la migration des CPN.
- Les CPN injectées se sont différenciées en neurones immatures puis matures au fil du temps.
- La méthode a démontré un potentiel pour des applications en thérapie par cellules nerveuses.
Conclusions
- La technique d'injection développée est efficace pour la transplantation de cellules progénitrices neurales.
- Cette méthode peut améliorer la recherche sur le développement et la réparation du cerveau.
- De futures études pourraient explorer des applications thérapeutiques dans les maladies neurodégénératives.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La modélisation de la transplantation de cellules progénitrices neuronales dans des organoïdes cérébraux humains fournit une plateforme reproductible et sans utilisation d'animaux pour évaluer l'intégration et la différenciation cellulaires dans des contextes de maladies du système nerveux central. Cette approche permet une évaluation prédictive des stratégies de thérapie cellulaire neuronale au stade préclinique de la découverte, soutenant la réduction des risques mécanistiques et la continuité translationnelle des portefeuilles en neuro-régénération.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet d'analyser le comportement des cellules progénitrices neuronales dans un modèle cérébral tridimensionnel pertinent pour l'humain.
- Permet une détection mécanistique des risques en suivant la prolifération, la migration et la différenciation cellulaires après transplantation.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles thérapeutiques pour les candidats aux thérapies cellulaires du système nerveux central.
Développement de tests et criblage
- Établit un protocole standardisé et reproductible pour l'injection et le suivi de cellules neuronales dans les organoïdes.
- Permet d'obtenir des résultats quantitatifs par microscopie à fluorescence pour l'analyse du destin cellulaire et de l'intégration.
- Prépare des systèmes d'organoïdes validés pour des criblages ultérieurs de composés ou d'éléments génétiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur la modélisation pertinente pour les troubles du système nerveux central en utilisant des organoïdes dérivés de cellules humaines.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique des approches de thérapie cellulaire.
- Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque en modélisant l'intégration neuronale humaine ex vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dans la continuité découverte-préclinique pour la thérapie cellulaire du système nerveux central, en reliant les premières études mécanistiques et la modélisation translationnelle.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant l'engraftement et la différenciation de cellules neuronales dans un contexte humain.
- Criblage : Fournit des mesures reproductibles et quantitatives du destin cellulaire et de la migration.
- Analyse : Permet la comparaison statistique des résultats de transplantation entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Offre une plateforme pour évaluer le comportement de cellules thérapeutiques dans des organoïdes pertinents pour la maladie.
- Réutilisation en milieu industriel : Propose un système évolutif, sans utilisation d'animaux, adaptable à divers programmes de thérapie cellulaire du système nerveux central.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les mécanismes et l'intégration des thérapies cellulaires neuronales.
- Valeur opérationnelle : Normalise la modélisation de la transplantation avec une perturbation tissulaire minimale et une forte reproductibilité.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant pour les candidats aux thérapies cellulaires du SNC en fournissant des données pertinentes pour l'humain dès les premières étapes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs de thérapie cellulaire ciblant les troubles du SNC.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches, manipulation d'organoïdes et techniques de microinjection.
- Requiert un accès à une microscopie à fluorescence et à une infrastructure d'incubation contrôlée.
- Exige une standardisation interéquipes pour des protocoles reproductibles de préparation et d'injection des cellules.
- Adaptable à diverses sources de cellules progénitrices neuronales et modèles d'organoïdes.
- Limité à la modélisation ex vivo ; la traduction in vivo nécessite une validation supplémentaire.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026