Décellularisation et Recellularization des foies entiers

L'objectif général de cette procédure est de préparer des greffons hépatiques de taille définie en utilisant une matrice hépatique décellularisée. Cette opération s'effectue tout d'abord par la canulation d'un foie donneur. L'organe est ensuite décellularisé par perfusion avec une série de solutions détergentes.

La révascularisation de la matrice hépatique décellularisée est ensuite réalisée en introduisant des hépatocytes primaires adultes par perfusion. Enfin, un système de perfusion in vitro est utilisé pour cultiver la greffe hépatique cellularisée. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant la fonction hépatique des greffes redimensionnées in vitro, par la mesure de la sécrétion d'albumine, d'urée et d'acides biliaires totaux dans le milieu de perfusion.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la fabrication de supports à l'aide de biomatériaux synthétiques ou les techniques traditionnelles d'ingénierie tissulaire, réside, selon moi, dans la présence d'une composition matricielle extracellulaire spécifique au tissu. Le support décellularisé par perfusion possède également une microarchitecture spécifique au tissu, comme la structure vasculaire. La présence de cette structure vasculaire nous permet de réintroduire les cellules dans le support de manière plus uniforme.

Il permet également de le perfuser uniformément avec des nutriments afin d'améliorer la survie cellulaire. La partie ralentissement du protocole sera démontrée par Nima, en collaboration avec le chercheur postdoctoral en charge de la structure postérieure dans notre laboratoire. La partie réétalonnage sera démontrée par Gabriel Price, qui est également chercheur postdoctoral.

Son travail porte sur l'industrialisation de ces greffes. Pour réaliser une décantonnisation par perfusion, commencez par prélever un foie de rat par canulation de la veine porte. À l'aide d'un cathéter de 18 g, laissez la veine cave inférieure et la veine cave supérieure ouvertes. Maintenez l'organe hydraté dans du chlorure de sodium tamponné au phosphate ou PBS dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.

Ensuite, mettez en place un système de perfusion composé d'un réservoir de huit litres, d'une pompe péristaltique et d'un piège à bulles. Remplissez le système de perfusion avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS et faites-le fonctionner pendant 10 minutes. Puis, remplissez une boîte de Pétri de 10 centimètres avec du PBS et réduisez le débit du tampon à 1,2 millilitre par minute.

Transférez soigneusement le foie récolté dans la boîte de Pétri contenant du PBS et laissez-le perfuser toute la nuit. Le jour suivant, perfusez le foie avec du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,01 % dans de l'eau distillée pendant cinq minutes.

Ensuite, revenir au PBS pendant une heure. Répéter les étapes de perfusion au SDS et au PBS trois fois supplémentaires, en augmentant le temps de perfusion au SDS à 10, puis 15, et enfin 20 minutes. Puis perfuser le foie selon la série suivante : 0,01 % de SDS pendant 24 heures.

0,1 % SDS pendant 24 heures. 0,2 % SDS pendant trois heures, 0,5 % SDS pendant trois heures. Eau distillée pendant 15 minutes, 1 % de Triton X-100 dans de l’eau distillée pendant 30 minutes, ce qui éliminera tous les acides nucléiques liés.

Et enfin, du PBS pendant deux heures, afin de laver la matrice hépatique décellularisée ou DLM après la perfusion, si désiré, résection de tous les lobes sauf le lobe médian. Conserver la DLM dans une boîte de Pétri propre et hermétiquement fermée, dans du PBS à quatre degrés Celsius, jusqu'à son utilisation pour stériliser la DLM. La rincer avec du PBS stérile contenant 0,1 % d'acide peroxyacétique et 4 % d'éthanol, puis l'incuber pendant trois heures à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez le MGD deux fois avec du PBS stérile. Puis avec du PBS contenant 2 % de pénicilline-streptomycine, 10 microgrammes par millilitre de gentamicine et 2,5 microgrammes par millilitre d'amphotéricine B. Conservez le foie décellularisé dans la même solution à quatre degrés Celsius jusqu'à son utilisation pour des expériences de recellularisation.

Deuxièmement, cellulariser une matrice hépatique décellularisée sous une hotte de culture tissulaire. Commencez par un système de perfusion similaire à celui utilisé pour décellulariser le foie. Remplissez le système de perfusion avec 200 millilitres de milieu de culture, tel que le DMEM à forte teneur en glucose, 10 % de sérum de veau fœtal, 100 unités par millilitre de pénicilline et 100 microgrammes par millilitre de streptomycine.

Placer le DLM dans la chambre de perfusion et le connecter au système de perfusion par l'intermédiaire de la canule de la veine porte, la pompe fonctionnant à cinq millilitres par minute. Pour éviter la formation de bulles d'air, laisser le milieu perfuser le DLM pendant 30 minutes. Ensuite, arrêter l'écoulement dans le système de perfusion et injecter lentement 50 millions d'hépatocytes isolés d'un rat adulte dans le système de perfusion par le piège à bulles.

Redémarrez le débit à 10 millilitres par minute et recirculez le milieu pendant 10 minutes. Arrêtez à nouveau l'écoulement du milieu. Injectez 50 millions d'hépatocytes supplémentaires.

Ensuite, redémarrer le débit à 10 millilitres par minute. Répéter cette procédure jusqu'à ce qu'un total de 200 millions d'hépatocytes ait été introduit dans le DLM. Une fois toutes les cellules injectées dans le DLM, recueillir le flux de sortie dans des tubes de centrifugation de 50 millilitres et centrifuger à 800 tr/min pendant cinq minutes.

Jetez les surnageants et regroupez les culots dans un seul tube. Déterminez le nombre de cellules et leur viabilité par exclusion du bleu de tripan. Pour établir l'efficacité de semis en culture.

Cellulariser une greffe de foie. Mettre en place un système de perfusion stérile comprenant un oxygénateur. Remplir le système de perfusion avec 50 millilitres de milieu de culture, comme le Williams E contenant 5 % de PBS et 0,5 unité par millilitre d'insuline.

20 nanogrammes par millilitre d'EGF, 14 nanogrammes par millilitre de glucagon, 7,5 microgrammes par millilitre d'hydrocortisone, 100 unités par millilitre de pénicilline et 100 microgrammes par millilitre de streptomycine. Placer la greffe hépatique cellularisée dans la chambre de perfusion et la connecter au système de perfusion par l'intermédiaire de la canule veineuse porte tandis que la pompe fonctionne à cinq millilitres par minute.

Pour éviter la formation de bulles d'air, fermer de manière aseptique la chambre de perfusion et la sceller hermétiquement afin d'éviter toute fuite pendant la culture. Incuber le système de perfusion à 37 degrés Celsius avec 10 % de dioxyde de carbone et augmenter le débit de perfusion à 15 millilitres par minute. Connecter l'oxygénateur à une bouteille de mélange gazeux composé de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone, et régler le débit gazeux à 0,5 litre par minute.

Cela devrait permettre d'obtenir une pression partielle d'oxygène d'environ 400 millimètres de mercure. Poursuivez la culture jusqu'à 10 jours avec des changements quotidiens du milieu de culture. Prélèvez le milieu quotidiennement pour doser l'albumine, l'urée et la sécrétion totale d'acides biliaires afin de surveiller les fonctions hépatiques de la greffe à la fin de la période de culture.

Prélève le greffon hépatique cellularisé pour une analyse moléculaire et histologique. La décéléllularisation complète d'un foie de rat prend environ 72 heures en utilisant le protocole décrit.

La matrice résultante conserve 100 % du collagène fibrillaire, 50 % des glycoaminoglycanes et seulement 5 % de l'ADN du foie natif. La structure vasculaire de la matrice est préservée, comme en témoignent les analyses par moulage de corrosion et par microscopie électronique à balayage. La présence de la microarchitecture vasculaire au sein de la DLM facilite sa recolonisation par des cellules avec une efficacité de 96 %, ainsi que sa perfusion ultérieure.

Pour la culture in vitro, la greffe hépatique peut être cultivée jusqu'à 10 jours in vitro et présente des fonctions hépatiques adéquates, confirmées par la sécrétion d'albumine, d'urée et d'acides biliaires totaux. Ainsi, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de décellulariser et de recellulariser l'ensemble du foie.