Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:16 min • August 29th, 2025
Le polyphosphate inorganique (polyP) est un polymère de phosphate linéaire impliqué dans la virulence bactérienne et la réponse au stress, stocké sous forme de granules cytoplasmiques.
Pour quantifier le polyP, prendre une plaque multipuits avec des concentrations croissantes d’étalons de phosphate inorganique.
Ajoutez l’extrait bactérien poly P purifié dans un puits vide.
Introduisez un tampon de réaction contenant l’enzyme exopolyphosphatase dans chaque puits et incuberez.
L’enzyme clive le polyP en phosphate inorganique libre, le convertissant en une forme quantifiable.
Ajouter un réactif de détection contenant du molybdate et de l’acide ascorbique et incuber.
Le molybdate réagit avec le phosphate pour former des complexes de phosphomolybdate, qui sont réduits par l’acide ascorbique en complexes de couleur bleue.
Mesurez l’absorbance du complexe coloré. L’absorbance mesurée correspond à l’intensité de la couleur bleue qui est directement proportionnelle à la concentration en phosphate.
Générez la courbe standard et calculez les niveaux de phosphate de l’échantillon, en reflétant la teneur originale en polyP de la bactérie.
Commencez par préparer des étalons contenant zéro, cinq, 50 ou 200 micromolaires de phosphate de potassium dans un pH de 50 millimolaires et huit chlorhydrates de tris.
Aliquote 100 microlitres de chaque étalon de phosphate et 100 microlitres d’échantillons de polyP extraits dans des puits séparés d’une plaque transparente de 96 puits. Préparez un mélange maître contenant, par échantillon, 30 microlitres de tampon de réaction 5X ScPPX, 19 microlitres d’eau et un microlitre de ScPPX purifié. Ajoutez 50 microlitres de mélange maître dans chaque puits de la plaque de 96 puits.
Et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Le jour de la détection, préparez un nouveau stock de solution de détection en mélangeant à 9,12 millilitres de base de solution de détection avec 88 millilitres d’acide ascorbique molaire, et laissez-le revenir à température ambiante avant utilisation. Ajoutez 50 microlitres de solution de détection à chaque échantillon et étalons dans la plaque à 96 puits.
Pour permettre le développement de la couleur, incubez la plaque à température ambiante pendant environ deux minutes. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez l’absorbance à 882 nanomètres et calculez la concentration en phosphate de chaque échantillon par rapport à la courbe standard du phosphate de potassium. Convertissez ensuite les concentrations de phosphate en nanomoles de phosphate dérivé du polyP dans chaque lysat cellulaire et normalisez la teneur en polyP cellulaire en protéine cellulaire totale, comme décrit dans le manuscrit.