Un test pour la quantification du polyphosphate inorganique chez les bactéries

Le polyphosphate inorganique (polyP) est un polymère de phosphate linéaire impliqué dans la virulence bactérienne et la réponse au stress, stocké sous forme de granules cytoplasmiques.

Pour quantifier le polyP, prendre une plaque multipuits avec des concentrations croissantes d’étalons de phosphate inorganique.

Ajoutez l’extrait bactérien poly P purifié dans un puits vide.

Introduisez un tampon de réaction contenant l’enzyme exopolyphosphatase dans chaque puits et incuberez.

L’enzyme clive le polyP en phosphate inorganique libre, le convertissant en une forme quantifiable.

Ajouter un réactif de détection contenant du molybdate et de l’acide ascorbique et incuber.

Le molybdate réagit avec le phosphate pour former des complexes de phosphomolybdate, qui sont réduits par l’acide ascorbique en complexes de couleur bleue.

Mesurez l’absorbance du complexe coloré. L’absorbance mesurée correspond à l’intensité de la couleur bleue qui est directement proportionnelle à la concentration en phosphate.

Générez la courbe standard et calculez les niveaux de phosphate de l’échantillon, en reflétant la teneur originale en polyP de la bactérie.

Commencez par préparer des étalons contenant zéro, cinq, 50 ou 20